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(無題) 削除/引用 No.3956-11 - 2015/03/25 (水) 08:07:19 - mon (1)おおさんが指摘していますが、特にファミリー遺伝子群の場合リガンドとレセプターの対応は1体1でない可能性、(2)結合するだけでシグナルを伝えない（＝他のリガンドの結合を阻害する）可能性（アンタゴニスト）、(3)（スクリーニング過程においてリガンド濃度が高すぎる等で）親和性が著しく低いレセプター（よって生理学的機能はないと考えられる）も見つかる可能性（「偽陽性1」）、(4)親和性があっても発現時期・場所等が異なり、生体内では出会うことがないペアである可能性（「偽陽性2」)、(5)高親和性であっても発現量が著しく低くスクリーニング過程で見逃す可能性（「偽陰性」）、(6)レセプターファミリー遺伝子以外にもレセプターが存在するする可能性、等を念頭に置いて、戦略を練ってください。 (1)~(5)を検証する為にも、レセプターファミリー遺伝子を全部用意するのが結局早い、確実かなと思います。一昔前なら遺伝子クローン化技術が未熟・高価で大変でしたが、試薬等の性能が格段に上がっていますし、お金があれば全合成も依頼出来ますから（ヒトやマウスだと発現ベクター入りで買えますね）。長いcDNAの増幅・クローン化もシークエンス確認にも使えるように1kbほどに分割してprimerを設計すると安価で（さほど？）難しくないですよ（まとまった数の発注だと、\15~20/merほどかな？）。なお、AP-TAG kitに関してはaddgene等で同様なものが安価に購入できるかもしれません（SEAP遺伝子を使って自作するか？）。

(無題) 削除/引用 No.3956-10 - 2015/03/24 (火) 10:51:27 - おお ゲノムの情報があって、候補があるんだったら１０個ぐらいならそれぞれあたっていけばいいのでは？ リガンド―レセプターの関係は1：1とも限りませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3956-9 - 2015/03/23 (月) 17:44:19 - mon ＞「リガンドは、サブファミリーの一種で....ほとんど受容体は明らかにされていません。」の説明について、正確な状況が不明なので書き直します。誤りがあったら指摘してください。 「目的リガンドはまずマウスで発見・クローン化され、マウスでは相同性からファミリー(遺伝子）が見つかっている。他のファミリー遺伝子ではレセプターが同定されているものもあるが、目的リガンドでは不明である。アミノ酸配列からは既知のドメインが見つかっている（構造的？ドメインの機能は不明？）。レセプターも相同性が高くファミリーを形成している。」 「目的魚類でも、マウスリガンドの相同遺伝子が見つかっており、ファミリー遺伝子も見つかっている。マウス遺伝子との相同性検索によりレセプター候補遺伝子も10 種以上ゲノムから発見されている。」

(無題) 削除/引用 No.3956-8 - 2015/03/23 (月) 15:12:12 - mon 「レセプター候補は10以上あります」との事ですが、その候補以外には無いと考えられますか？あるいは探す予定ですか？ 遺伝子配列が分かっているなら、直接的な検討が良いと思う。 その候補が20種くらいの有限数なら全部クローン化して発現ベクターに組み込み、 (1)さらにリガンドの細胞外ドメイン+タグのみを可溶性発現・調製が可能なら、リガンドがレセプター候補を発現する細胞表面に結合するか否かをタグに対する蛍光抗体等で観ればよいかと。あるいはタグに対するHRP標識抗体（二次でもよい）とビオチンチラミンを使い、レセプター候補タンパクにビオチンが転移されるかを検出する方法もある。DSP等のクロスリンカー＋免疫沈降等で直接結合しているか否かをみることも出来る。最終的には精製タンパクを用いて相互作用を検討することも必要かな。 (2)リガンドの細胞外ドメインの可溶性発現が困難で、レセプター候補の細胞外ドメインは可溶性発現可能なら、上記の逆を行う。 (3)両者とも可溶性発現が困難だと、（過剰）発現細胞同士の接着で観れるかな？？？ リガンドとレセプターが結合すると生じる細胞内シグナルを可視化（あるいは数値化）できれば、相互作用の証明は容易ですね。

(無題) 削除/引用 No.3956-7 - 2015/03/23 (月) 14:18:42 - 質問です また、AP-TAG kitを用いてレセプター、リガンドの関係性を明らかにできるだろうと考えているのですが、コスト的に難しいと感じております。

(無題) 削除/引用 No.3956-6 - 2015/03/23 (月) 14:16:51 - 質問です 申し訳ありません。 今現在、分かっている事は あるゲノム解読が終了している魚類を対象に、レセプターの同定を行おうと考えています。 リガンドは、サブファミリーの一種で、膜結合型であり、ドメイン構造を持っいます。レセプターも同様にドメインを持っています。マウスから単離されたリガンドであり、他のサブファミリーとは異なり、ほとんど受容体は明らかにされていません。（レセプター候補は、10以上あります）

(無題) 削除/引用 No.3956-5 - 2015/03/23 (月) 13:34:15 - おお くっつけばレセプターの可能性がありますよね。また、リガンドの添加でその下流のシグナルやその結果として細胞などが変化すればそのリセプターをもっているといえますよね。 たいていそういうのを指標にしてアッセイ系を作ったりします。方法論的には今ある情報や使える系その他に左右される、言い換えればそれぞれの状況にあわせて自身で独自の方法論をとる（独自と書きましたがすでに使われているような手法をふくめて ）ことになろうかと思います。 工夫、考え方次第ではあまり一般的にやらない方法論をとれる可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.3956-4 - 2015/03/23 (月) 13:08:20 - mon もう二点、 リガンドを保有しているのか、否か。量は？ レセプターが含まれている環境（培養上清、細胞、組織等）は大量に用意出来るのか、否か。

(無題) 削除/引用 No.3956-3 - 2015/03/23 (月) 13:02:38 - mon 「ざっくり」感の根源は、テーマの割に以下の事が開示されていないからです。 微生物なのか、菌類なのか、動物なのか、植物なのか。 リガンドは、peptide/タンパク(遺伝子でコードされているもの）なのか、核酸、化合物なのか。 その対象生物のゲノム配列は公開されているのか、否か。 レセプターは細胞外、細胞表面、細胞内のどこにあると想定しているのか、あるいは全く不明なのか？ リガンドとレセプターが結合するとどのような現象が生じるのか、あるいは不明なのか。 RI標識が使える環境なのか否か、遺伝子組換え実験・培養実験が可能なのか。 予算・マンパワーは？

(無題) 削除/引用 No.3956-2 - 2015/03/23 (月) 12:44:31 - mon レポート課題でしょうか？一つも思いつかないのでしょうか？ 「ざっくり」し過ぎていて、教科書をお読みください、としか言えないですね。

レセプターとリガンドの同定方法 削除/引用 No.3956-1 - 2015/03/23 (月) 11:41:57 - 質問です レセプターとリガンドの同定方法を教えて頂きたいです。ある目的のリガンドに対するレセプターを同定したいと考えています。

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