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(無題) 削除/引用 No.3951-13 - 2015/03/22 (日) 09:21:05 - L Tetraploid G1細胞をHoechstとFucci（Cdt1-cherry陽性/Geminine-venus陰性）で単離する事が目的で、基礎実験としてHoechst単独の染色（Fucciを導入していないMCF7）で4Nのピークを見ているという理解してよろしいでしょうか？　それとも、既にFucciが入っているMCF7でHoechstの実験を行っているという事でしょうか？ もし前者であれば、一回固定してHoechstとPIで2N/4Nのピークに違いがあるかどうか確認しておいた方が良いかもしれません。どちらの染色でも１ピークであれば、Hoechst染色の問題というよりは、細胞の状態が悪くてどこかのフェーズでブロックがかかっている可能性がありますから。もしくはS期の細胞が多くて4Nのピークがはっきりせず、G1とSが一塊の山になって見えている可能性もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3951-12 - 2015/03/20 (金) 15:27:17 - サンショウウオ 詳しく理解していないけど、 mCherryをCFPとかEBFPに変えたくなった。

(無題) 削除/引用 No.3951-11 - 2015/03/20 (金) 12:23:28 - もるもる いわゆるDNAの染色に基づく「きれいな」細胞周期解析は固定が重要です。 エタノール固定（PFAではだめ。メタノールで行くかは情報を持ち合わせていません）じゃないときれいなピークに分かれません。 質問者さんの実験では、生細胞を扱っているのでしょうから、なかなか難しいと思います。 そもそも実験系を変える必要があると思います。

Hoechst33342を用いた生細胞単離 削除/引用 No.3951-10 - 2015/03/20 (金) 12:01:25 - いく おおさん、私の理解不足？さん御意見ありがとうございます 説明が不足していました申し訳ございません。 生細胞数と死細胞を分けるのが目的では有りません 私が現在、研究しているのは４N領域かつG1期(老化細胞のような)の単離です 説明を省略させて頂いていましたが、詳しく説明致します 乳がん細胞にFucciを導入した細胞を用いております Fucciは細胞周期のインディケーターであり、 cdt1-mcherryとGeminine-mVenusを遺伝子導入しています また、死細胞を測定するときPIはmcherryと波長が重なってしまっており、用いることは出来ません こちらが問題点になります。 �@Hoechst33342によって核が染まっていることは確認済み �Aしかしながら、細胞周期の測定を行うと1ピークになる

(無題) 削除/引用 No.3951-9 - 2015/03/20 (金) 02:24:35 - 私の理解不足？ ariaだから勝手に生細胞のソートが目的だと思ってましたが、、 ヘキスとを辞めてPIですかね。

(無題) 削除/引用 No.3951-8 - 2015/03/20 (金) 02:22:51 - 私の理解不足？ あれっ？ 実験目的はなんですか？ 細胞周期解析？ただの生細胞分離？ そこをきちんと明かしていただかないと。

(無題) 削除/引用 No.3951-7 - 2015/03/20 (金) 02:19:31 - 私の理解不足？ ヘキスト33342は幕透過性があるので生死に関わらず、全ての細胞は染まると思いますが？ PIのような膜透過性がない色素で染めてから生細胞の分離ができるのではないですか？ もちろん細胞周期の解析ならヘキストで問題ないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3951-6 - 2015/03/19 (木) 15:31:47 - おお 顕微鏡かで生細胞の状態で培地に１ug/mlぐらいで染めることがありますが。３０分もすればちゃんと染まってます。。。

Hoechst33342を用いた生細胞単離 削除/引用 No.3951-5 - 2015/03/19 (木) 12:17:29 - いく サンショウウオさん、33342さん御意見ありがとうございます。 33342さん 同時に観察する実験系として AnexinVをFITCで標識したものを使うことでアポトーシス細胞をFITCの波長で計測することができるのでアポトーシス細胞をゲート除去などで除くと生細胞を計測することが可能になると考えております。 (正確に分けるにはより細かな設定が必要かと思います) おそらくTakaraBioさんでkitが販売されていた気がします… サンショウウオさん 2000倍希釈で観察可能ということはHoechst33342の量はかなり薄くても大丈夫ということなんですね… 勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3951-4 - 2015/03/19 (木) 11:47:52 - 33342 Hoechst33342使ってますけど、細胞の生死に関わらずDNAが染まるのでどうやって生死判断してるのか気になります。 質問を返すようですみませんが、原理分かれば教えていただけますか。

連投失礼します 削除/引用 No.3951-3 - 2015/03/19 (木) 11:38:36 - サンショウウオ 経験上、Hoechstは1ml培地に対して5µl（2000倍希釈）加えて15分、37℃　5%　CO2でインキュベートした場合、共焦点顕微鏡での観察が可能なので、 FacsAriaのDetectorなら、60分もHoechstに晒さずとも核の蛍光は観察できると思います。

生死細胞染色なら 削除/引用 No.3951-2 - 2015/03/19 (木) 11:31:40 - サンショウウオ うちでは生死細胞染色やるとき 生細胞→Calcein AM（緑色蛍光波長）　　 死細胞→PI（Propidium Iodide）（赤色系光波長） 染色してるから、Hoechst（青色）でやる方法知らなかった。 参考になりました。

Hoechst33342を用いた生細胞単離 削除/引用 No.3951-1 - 2015/03/19 (木) 09:31:10 - いく いつも参考にさせていただいております。 現在、乳がん細胞MCF-7を用いて生細胞単離を行うため Hoechst33342で核染色し条件検討をしている段階なのですが 論文上のプロトコル＆BDの学術の方に教えていただいた方法でも上手くできません。 細胞周期が1ピーク(1山)のような状態です 測定している機械はFacsAria <方法�@> 培地にHoechst33342を44μl添加し、遮光し37度60分インキュベーションした後、 トリプシンで剥がして測定 <方法�A> トリプシンで細胞を剥がし、1×10^6/1mlになるように調整 Hoechst33342を5μl添加し、遮光し37度60分インキュベーションした後、測定 といった方法です。 Hoechst33342の量を5倍量までふたして検討しましたが、死細胞数が増加するだけで意味がありませんでした。 皆さんがどのような方法を用いてHoechst33342を用いた生細胞単離を行っているのかお聞きしたくトピックを作製させていただきました。 ご意見宜しくお願い致します。

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