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エタ沈Wash時のエタノール濃度 トピック削除
No.3949-TOPIC - 2015/03/18 (水) 09:36:16 - K
普段からRNAのエタノール沈殿(イソプロパノール使用)を行っています。しかし、今回のWashでは、遠心後沈殿が一か所に集まりににく、原因かもしれないエタノール濃度について教えていただきたいです。

普段は70％エタノールでWashしているのですが、70％エタノールの調整でミスって65％〜68％と少し低濃度のエタノールでWashしました。この程度の濃度差でも沈殿しやすさや、RNA再溶解に影響しますか？

補足)沈殿は見えていましたが、15000rpmで5分遠心しても通常集まる場所に集まりませんでした。乾燥後、沈殿は透明になったのでRNAだとは思います。
　
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エタ沈Wash時のエタノール濃度 削除/引用
No.3949-5 - 2015/03/20 (金) 01:02:10 - K
みなさん回答ありがとうございます<(_ _)>
皆さんの回答と実験結果を見て、もう一度原因を考えようと思います。
あとから思ったのですが、一回目の遠心後、イソプロパノールがかなり残っていたのが影響していたのかもしれないです。


monさんへ)80%と記載しているプロトコルは見たことがありますが、ほとんど70%だと思います。
表記の仕方がわかりづらくてすいません。再遠心しても沈殿がチューブ底の片側(遠心力がかかる側)ではなく底の真ん中にあったのが気になり、推敲せずに質問してしまいました。なので広く沈殿しているというよりは沈殿はあるけど、遠心力がかかる側に集まっていないという状況でした。状況が分かりづらい表記ですいません。
低濃度だと小分子のRNAが溶解しやすいなど、具体的に説明していただきありがとうございます。勉強になりました＾＾


AAさん)実体験をもとに説明ありがとうございます＾＾


774R)学会発表で時間が取れなかったので、RNAは分解しないよう風乾して保管しています。なのでこれから定量ということになります。どうしても気になったのですぐに質問してしまいました。不快な思いをさせたようならすみません。

(無題) 削除/引用
No.3949-4 - 2015/03/18 (水) 19:30:42 - 774R
で、実際の収量はどうだったのか？

質問する前に当然測定してますよね？

(無題) 削除/引用
No.3949-3 - 2015/03/18 (水) 14:29:32 - AA
学部生で一人で実験を始めたばっかりの頃、
間違えて70％のつもりで30％のエタノールを作り、使ったことがあります。
綺麗に全部30％エタノール中に溶解してしまいました。
その場にあった3M酢酸ナトリウムとイソプロでもう一度沈殿化させ事なきを得ましたが、
水分量が増えれば当然そちらに溶解してしまうので収量が落ちるのは当然かと思います。

(無題) 削除/引用
No.3949-2 - 2015/03/18 (水) 11:21:08 - mon
70%エタノールのWash(リンス：古い表現なのか？）を行う理由は、沈殿させる事ではなく、既にできている沈殿を溶かさずに、かつ再溶解の支障になる塩・イソプロパノール等の揮発しにくい溶媒を取り除く事です。
従って「この程度の濃度差でも沈殿しやすさや、RNA再溶解に影響しますか？」という質問は的外れです。
低濃度のエタノールだと、(特に低分子の）RNAの沈殿が一部溶解して収量が少なくなる懸念があります。（昔のmanualにはRNAの場合80%エタノールが良いと記載されていましたが今はどうなのかな？）
また「通常集まる場所に集まりませんでした。」とありますが、沈殿形成時の液量が多かったりすると沈殿が頑固にチューブ壁面(側面）に広く(薄く）付着していていることと良くあることです。とはいえ高濃度エタノールの方が沈殿が壁面から剥がれやすくなるため、チューブ底面に集まりやすくはなるでしょう。

エタ沈Wash時のエタノール濃度 削除/引用
No.3949-1 - 2015/03/18 (水) 09:36:16 - K
普段からRNAのエタノール沈殿(イソプロパノール使用)を行っています。しかし、今回のWashでは、遠心後沈殿が一か所に集まりににく、原因かもしれないエタノール濃度について教えていただきたいです。

普段は70％エタノールでWashしているのですが、70％エタノールの調整でミスって65％〜68％と少し低濃度のエタノールでWashしました。この程度の濃度差でも沈殿しやすさや、RNA再溶解に影響しますか？

補足)沈殿は見えていましたが、15000rpmで5分遠心しても通常集まる場所に集まりませんでした。乾燥後、沈殿は透明になったのでRNAだとは思います。
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