６０塩基前後の遺伝子（センスとアンチセンス）を某メーカーに合成してもらっている最中です。5'端には、BamHIサイト（切断された状態）と3'端には、SalI-ggg-EcoRVサイト（EcoRVサイトは切断された状態）を組み込んであります。5'端には、リン酸化するよう依頼してあります。
この遺伝子のセンスとアンチセンスを結合させる手順ですが、以下の通りでよろしいでしょうか？（GCリッチな配列です）
１．５０μLのdH2O入りのチューブをヒートブロックで96℃にする。
（以前、似たような実験で、10 x PCR バッファーや dNTP mix を加えていたのですが、意味がないように思います・・・いかがでしょうか？）
２．センスとアンチセンスを適量それぞれ加える。
（終濃度のマックスはどれぐらいまで可能でしょうか？）
３．５分間インキュベートベートする。
４．ヒートブロックのスイッチを切る。
５．３７℃ぐらいになるまでそまま待つ。
６．一部をベクター（BamHIとEcoRVで切断後）に挿入する。
以上、よろしくお願いいたします。 |
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