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(無題) 削除/引用 No.3938-11 - 2015/03/14 (土) 04:19:53 - 名無し シグナルが飽和してると（適正な量をアプライすれば本来は差異があるはずのものでも）みんな同じような値になるので、結果的にばらつきが少なく見えてるのではないでしょうか。あきらかに飽和して見えるシグナルは論文でも時々見かけます。なのでそれはそれで問題がある結果である可能性もあるとおもう。GAPDHやactinやtubulinなどはどれももともと量がかなり多い蛋白質なので、内部標準を利用する人は注意が必要とおもう。検量線描いて直線性のある範囲でアプライ量決めてからWesternしてそれを定量してる人は、まだわりといるので。 蛋白質パタンをスキャンして定量するならばこういう問題は起こりにくいとおもう。 Westernでの定量はまあ現実には半定量みたいなものだし、実験過程で結果に影響をあたえる要因はとても多いので、正確さについてはおのずと限界があるから、いちおう測定するだけしてみましたけど、くらいの感じかな、とおもうし、 目で見てよく分かるくらいの差でないと、その増減をあまりまじめに議論する意味はないような気がする。

ありがとうございました。 削除/引用 No.3938-10 - 2015/03/13 (金) 14:39:22 - ウエスタン初心者 統計のこともよくわかっていなかったので、遅くなってしまいました。 総じて傾向はあるようだと思って、データを見すぎてたのかもしれません。 エラーがあったり、その傾向から外れたものが１つでもあるとｎの数が少なかったら、母集団の推測できない、だから有意差がつかないのかなと・・・ 論文ごとに検定方法が違うのは、普通なんですね。 現在ボンフェローニしかやってないので、もうすこし勉強してみます。

(無題) 削除/引用 No.3938-9 - 2015/03/13 (金) 13:48:38 - qw ４群のn=5で常識的な結果を得ようとするとこんなふうになります。 Rで、power.anova.testを実行するとこうなります。 *********************************** Balanced one-way analysis of variance power calculation groups = 4 n = 5 between.var = 0.9302362　各群の平均値の分散 within.var = 1　　各群内の分散 sig.level = 0.05　いわゆるp値です power = 0.8　　多重検定で重要になるパワー *********************************** between.varとwithin.varがほぼ同じであるということは、比較するグループ間の差（between.var）が、データのバラつき（within.var）よりもやや大きくないと無理だということです。 だから、多重比較するような実験計画を避けるほうが良いだろうと思います。 多重比較しないといけないところで、t-testをそのままやりなさいといっているのではありませんので、誤解のないようにしてくださいね。

(無題) 削除/引用 No.3938-8 - 2015/03/13 (金) 13:28:53 - TS ttp://www.bio-rad.com/ja-jp/life-science-research/news/bio-rads-new-image-lab-software-automates-total-protein-normalization-for-more-accurate-western-blotting-analysis ttp://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6349.pdf このあたりを見ていただければ参考になるかと。 誤解されないでほしいのですが、b-actinなどの内部標準を使うのが今でも主流と思いますし、どちらのほうが必ず良いとかいう意見ではありません。 わたしは、総タンパク量で補正する方が良い感触を得ていますので、こっちを使うようになりましたが。

横から基本的なことですみませんが、、、 削除/引用 No.3938-7 - 2015/03/13 (金) 12:29:37 - おしえてください その最近はやっている総タンパクで補正するという方法ですが、なぜその方法が内部標準の代わりに使えるのかの理屈を教えていただけないでしょうか？ よろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.3938-6 - 2015/03/13 (金) 09:54:17 - TS 概して動物実験ではばらつきが大きくなりますね。 培養細胞はその点がかなり楽です。私的には、N=5だとそれなりにきれいに差が出る実験でないと有意差が出ないのではと思います（少なくとも２−３倍とか）。 ちなみに合計で20サンプルあると思いますが、一枚のメンブレンやゲルでやっているのでしょうか。メンブレンをまたぐと、転写効率や抗体反応の違いが結果に影響すると思います。 それとタンパク定量をしていて、同じタンパク量をローディングしていると思いますが、以外とサンプル間での差も残るものです。 わたしは、転写後にPonceauSで染めて、その染色強度で目的タンパク質のシグナル強度を補正しています。 B-actinなどの内部標準で補正する方法がスタンダードの一つと思いますが、 メンブレンに転写された総タンパクで補正するのも最近はやってきてると思います。私はその方がばらつきが小さくなると感じています。 統計についてですが、多群であれば多重検定で正解と私は思います。

(無題) 削除/引用 No.3938-5 - 2015/03/13 (金) 09:46:12 - おお コントロールの平均値に対してone sample t testという手もあるかと思いますが、どの程度受け入れられるかわかりません。まあいずれにしろ理論的には多重検定ということになりますが、そのへんは分野によりやるかどうか流儀的なものがあるかもしれません。one sample t testの場合はBonferroni法やHolm法になるかもしれません。 また、すべてコントロールに対する比較なら Dunnet法もつかえるかもしれません。 その違いがある傾向がみれる１群だけ統計処理をするということで多重検定を逃れるということも仮説の工夫で容認できるかもしれません。 同じサンプルで２、三回流して ＷＢのぶれが影響しているならその影響を低く抑えることができるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3938-4 - 2015/03/12 (木) 17:45:28 - ウエスタン初心者 ありがとうございます。原因としては４）以外は可能性はあると思います。 １）２）３）のエラーはどうしても出るとは思いますが、 かなり規格化しており、エラーがないように調整しているつもりですが どうしても差はあると感じます。 バンド自体の目で見た傾向はn=5で総じて傾向はありそうなのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.3938-3 - 2015/03/12 (木) 14:22:41 - qw 私は培養細胞しか使っていないので悪しからず。 まず、多重比較すべきでないだろうと思います。 コントロール５匹の結果は揃っているのですか、それともばらついているのでしょうか？ 内部標準のタンパクも見ているだろうと思いますが、そちらはばらついていないのですか？ そこで、ばらつく要因は何だと思いますか？ １）ラットのコンディションが一定でない。 ２）動物への処置が均一に実施できない。 ３）サンプル調製が均一に行えない。 ４）電気泳動や転写がうまく行かない。 ５）抗体との反応がうまく行かない。 ６）シグナルが弱すぎる、もしくは検出系のダイナミックレンジが低いので、ばらついて見える。 まあ、この位の事しか言えない。

ウエスタン定量にたいするｎ数について 削除/引用 No.3938-1 - 2015/03/12 (木) 13:24:32 - ウエスタン初心者 本当に初歩的な質問で申し訳ございません。 タンパクをＷＢで定量する際、in vivoでn=5の組み合わせを作って 検討しています。 つまり実験群が�@、�A、�Bとある場合、コントロールと合わせて、 ラットが20匹の個体でサンプルを採取している状態です。 しかし、それぞれの反応性がばらつきが多く、 ある程度の傾向はみられるのですが（平均してグラフを作ると傾向は出てます）、ＯＤ値で定量してもエラー値が大きくなってしまい、多重検定すると有意差がでてきません。 ほかの論文を拝見しましたが、定量している時、n=5とあっても、 そこまでエラー値がなかったり、同様に５回実験したとあったりして・・・ この意味は、自分の仮説を支持する一番いいデータを同じ手技で５回実験したということなんでしょうか？ エラーの幅がこんなに狭いことがありうるのかな、と思うのでついついそう考えたくなってしまいます。 どうされているのか教えていただけたら幸いです。

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