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マウス脾細胞からのDC分取 トピック削除
No.3937-TOPIC - 2015/03/11 (水) 20:50:20 - DC分取
現在マウスの脾細胞からDCを分取して行う実験をしています。
初歩的な質問で恐縮ですが、周りにあまり経験のある人がおらず、ご教示いただければと思ってご質問させていただきました。

マウス脾臓を摘出後、HANKS＋collagenaseD（約550mandlU/ml）のDigestion mix中でつぶし、37℃で30〜45分程度インキューベートした後に回収しています。

そこで、通常のマウスと炎症を起こしているマウスで比較したいのですが、炎症を起こしている、起こしうるマウスでは、digestion後に粘性の塊が残ってしまって、回収ができなくなってしまいました。
インキュベーション時間を長くしても改善せず、collagenaseで反応しきれていないもの、というわけではなさそうでした。

DNase処理やEDTA処理など、目に留まったプロトコールを試してみて、うまく取れることもあるのですが、DNaseやEDTAを使っても、上のようなものが残ってしまって、遠心しても血球成分が取れてこないことがあります。

ストレーナー上でつぶすなど、collagenaseを使わない回収方法も試しましたが、回収効率が悪いのか、十分量取れてきませんでした。
マウスの実験なので、個体差があるのは仕方がないとは思うのですが、炎症を起こしている、脾腫が起きているなどのマウスで回収がうまく行かなくて困っています。
ご経験などご教示いただければ幸いです。
どうぞよろしくお願いいたします。
　
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お礼 削除/引用
No.3937-4 - 2015/03/16 (月) 21:55:20 - DC分取
はるきさま,aさま

ご意見いただき、ありがとうございます。
セルストレーナーを通すとくっつきやすい細胞がロスしてしまうのかもと思っていましたが、フィルタリングは結構大事そうですね。

また、冷却することについてもありがとうございます。
最初にマウスの実験をし始めたときに、（DNaseの反応以外でも）脾臓は温めたメディウムで細胞を回収するように言われていたので、逆によくなかったかもしれません。

貴重なアドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.3937-3 - 2015/03/16 (月) 13:17:31 - a
脾細胞の調整方法ですが、わたしは下記のようにしています。

1)シャーレの上に4℃PBSで表面を洗浄した脾臓を置く
2)先曲りピンセットで脾臓を破裂しない程度に上から押しつぶす、全体をまんべんなく行う
3)ピンセットをもう一本用意し、脾臓の片側を抑えて先曲りピンセットの腹で脾臓をこそぐ(たらこの中身を出すかんじ)
そうすると、膜の一部が圧で破けて中の細胞が出てきます
4)4℃PBSで懸濁してセルストレーナーを通すと、膜1枚しか残りません
5)必要であれば溶血させてから試験に用いる、反応は氷上で行う

私は今までやった中でこの方法が一番回収率がいいです。
一般論として、凝集しないように気を付けるポイントは冷却することと遠心の回転数を下げることででしょうか。あとは凝集してしまったマクロファージや好中球の塊をトリプシン処理してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3937-2 - 2015/03/16 (月) 10:59:24 - はるき
私自身がやったことがあるわけではないのですが、研究室で免疫をテーマにやっている先生がおり、その先生の手技を目にしたことがある程度という事で読んでください。
あまり詳しいことは分かりませんが、必ずフィルタリングをしていたのを覚えています。元々ソーティングする予定でもあったことから、繊維組織が邪魔なのでしょう。それで100%解消されるわけではありませんが、繊維の塊は大体取れていたという話をせからきいた覚えがあります。
参考になるかわかりませんがお役に立てれば幸いです。

マウス脾細胞からのDC分取 削除/引用
No.3937-1 - 2015/03/11 (水) 20:50:20 - DC分取
現在マウスの脾細胞からDCを分取して行う実験をしています。
初歩的な質問で恐縮ですが、周りにあまり経験のある人がおらず、ご教示いただければと思ってご質問させていただきました。

マウス脾臓を摘出後、HANKS＋collagenaseD（約550mandlU/ml）のDigestion mix中でつぶし、37℃で30〜45分程度インキューベートした後に回収しています。

そこで、通常のマウスと炎症を起こしているマウスで比較したいのですが、炎症を起こしている、起こしうるマウスでは、digestion後に粘性の塊が残ってしまって、回収ができなくなってしまいました。
インキュベーション時間を長くしても改善せず、collagenaseで反応しきれていないもの、というわけではなさそうでした。

DNase処理やEDTA処理など、目に留まったプロトコールを試してみて、うまく取れることもあるのですが、DNaseやEDTAを使っても、上のようなものが残ってしまって、遠心しても血球成分が取れてこないことがあります。

ストレーナー上でつぶすなど、collagenaseを使わない回収方法も試しましたが、回収効率が悪いのか、十分量取れてきませんでした。
マウスの実験なので、個体差があるのは仕方がないとは思うのですが、炎症を起こしている、脾腫が起きているなどのマウスで回収がうまく行かなくて困っています。
ご経験などご教示いただければ幸いです。
どうぞよろしくお願いいたします。
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