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(無題) 削除/引用 No.393-6 - 2012/04/11 (水) 19:16:06 - あくね １５年程前に類似した研究を行っていました。当時、検出系の構築には苦労しました。 ポリメラーゼは組換え型ですし、大気を含めて、試薬、水、チップ、チューブには（環境）菌由来のDNAが必ず存在します。極力、全てについて細菌混入の無い”きれいな”ものを使う必要があります。｢血中ﾊﾞｸﾃﾘｱ検出に最適なDNAキット｣（どのようなものか存じませんが）を使われることは良いことだと思います。 ご存知で対策済みであれば申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.393-5 - 2012/04/11 (水) 10:42:47 - マルチ 非特異は血中成分由来でしょうか？他のバクテリア由来でしょうか？ 前者ならキットを最適なものに変えれば改善されます。 後者なら標的を16Sから変更するか、プライマーにアダプター配列を付けて2nd PCRするなどの工夫が必要です。 どんなにプライマー配列を吟味しても16Sはクロスが必ず見られますよ。

(無題) 削除/引用 No.393-4 - 2012/04/11 (水) 09:10:25 - ~ 菌の目安がついているのであれば、 単離・培養した菌より抽出したゲノムDNAで、PCRの条件検討をしてみてはいかがでしょうか。 同時に適当な培養ヒト細胞のゲノムDNAも並べてみるとよりいいでしょう。 非特異バンドが多数あるのであれば、配列を読むのは負担だと思います。 きれいなテンプレートを用意して、バンドが大腸菌由来なのか、ヒト細胞由来なのかを切り分けると、 次のステップに進みやすいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.393-3 - 2012/04/11 (水) 07:54:20 - Harmonia 興味本位。 血中バクテリアって何種類くらい居るの？ 分かっている数と、実際に１採血中に存在した数。

情報不足 削除/引用 No.393-2 - 2012/04/11 (水) 07:46:52 - mon 情報が少なくアドバイスしにくいので、非特異的バンドの原因を切り分けて下さい。 例えば、primer配列を含むPCR 条件にあるのか、抽出したDNAにあるのかは、確定していますか？どのような検討で判断したかも教えてください。

血中ﾊﾞｸﾃﾘｱ　PCR 削除/引用 No.393-1 - 2012/04/10 (火) 21:45:03 - saikinn 初歩的な質問で申し訳ありません。菌血症の研究をしております。全血採取量1mlとし、DNAを抽出後、16SrRNAﾌﾟﾗｲﾏｰ、E.coliﾌﾟﾗｲﾏｰを用いたPCR法による定量を実施しようとしておりますが、さまざまな条件設定を行っても目的とするバンド以外にも非特異バンドが多数検出されてしまいます。非特異的バンドのシークエンスを今後行い確認を行う予定でいるのですが、その他細菌のPCR実施法についてアドバイスがありましたら教えていただけますでしょうか。DNA抽出キットは｢血中ﾊﾞｸﾃﾘｱ検出に最適なDNAキット｣とうたわれているものに変更した方が良いのでしょうか。宜しくお願いいたします。

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