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誤送信 削除/引用 No.3911-13 - 2024/03/06 (水) 19:27:05 - おす 投稿先を間違えました。 失礼しました。

ヒト採血後のフローサイトメーターによる解析について 削除/引用 No.3911-12 - 2024/03/06 (水) 19:21:10 - おす 臨床現場で採血後にフローサイトメーターを用いCD4,CD8T細胞、MDSC、Tregを調べたいと考えています。 採血後にすぐに解析することが基本的だと思いますが、現状、採血後すぐに実験することが難しい場合があります。そこで、採血後、数時間してから解析する場合、下記条件下での再現性や安定性について教えていただきたく存じます。 ・採血後、全血の状態で常温保存した場合 ・採血後に速やかにPBMCを回収し、凍結保管し数日後に解析した場合 見たい細胞やたんぱく質によると思いますので、予備検討はしてみようと考えております。参考までに何か経験談などございましたら教えていただけると幸いです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3911-11 - 2015/03/18 (水) 09:01:32 - L すいません。ちょっと軽率でした。私が上司であったとしても、はるきさんのボスと同じ事を言うと思うので、固定や凍結保存を勧めているように受け取られかねないコメントは良くなかったと、反省しています。 どうしても固定が必要な場合にどうすればよいかを提案しただけですので、新鮮サンプルでセットアップ中であれば、先生の指示に従うべき状況と思います。固定を前提とするならば、その前提でセットアップする必要があり、先生とよく相談して、お互い納得した形で次の段階に進むべきかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3911-10 - 2015/03/17 (火) 18:57:50 - flowjoe >フローサイト実験系を立ち上げている最中なので・・・ 固定の問題は数回実験すればわかることです。 現在できていることから順番に進めているのですからボスにしたがっておくべきだと思いますよ。 今回の質問の仕方でFCMの原理や抗体染色をしっかり理解しているとは思えません。ボスともめるとお互い不幸なのでしっかりボスと話し合ってください。

(無題) 削除/引用 No.3911-9 - 2015/03/16 (月) 17:18:09 - a b様 Protein様 製品の情報有難うございます。 L様 一番知りたかったことが解りました、有難うございました。 やはりFixでバックや抗体の反応性は変わってしまうのですね。 私が今後する実験もまさに動物の造血幹細胞のマウスへの移植で、生着確認ですので貴研究室のお隣さんのように凍結することも上司に再度提言してみようと思います。 はじめてで塩梅が解らない中、先生方のご回答大変参考になりました。 有難うございました

(無題) 削除/引用 No.3911-8 - 2015/03/14 (土) 05:44:20 - L 固定により、FSC/SSCやバックグランドの蛍光（自家蛍光）レベルが変わるのは間違いないと思います。固定するならば、固定細胞でのフローサイト解析の条件設定をきちんとやった方が良いと思います。固定により抗体との反応性も変わる可能性があるので、固定前に染色は終わらせておいた方が無難です。固定して１週間くらい4oC保存しても問題ないと思います。 私自身はやった事がありませんが、隣のラボには未染色の状態で凍結保存し、解凍後染色してフローサイトにかけている人がいます。その方の場合は、ヒトの造血系腫瘍細胞を移植したマウスから採取した細胞の解析を行っていて、ヒト抗原の検出は問題なくできているようです（ただし、生着確認目的の実験なので、厳密な定量性については気にしなくてよい状況のようです）。解析目的によっては、これでも良いかもしれませんが、厳密な定量実験であればお勧めできません。

BD stabilizing Fixative 削除/引用 No.3911-7 - 2015/03/14 (土) 03:38:38 - protein を使って固定して一日くらいは4Cにサンプルを置いています。 死細胞の除去に関してはFixableなdye (invitrogenのLive/Deadとか）を使う必要がありますが、 多くの場合問題がないように感じています。

(無題) 削除/引用 No.3911-6 - 2015/03/05 (木) 06:49:09 - b あとバフィーコート回収は、Ficoll分離バッファーの上に直接血液を乗せて遠心していますか？もしそうでしたら、シグマにAccuspinチューブというのがありますが、それを使うことをお勧めします。他社さんにも類似チューブはあります。バフィーコートの回収がだいぶ簡単になり、時間的にも精神的にもだいぶ楽になりました。

(無題) 削除/引用 No.3911-5 - 2015/03/04 (水) 11:19:35 - AA フローサイトの観点ではないですが、臨床採血サンプルの場合、 採血の現場での負担を増やすわけには行かないので、 抗凝固剤入の真空採血管で採血した全血をそのまま保存（4℃・冷蔵）、 その後送ってもらう手順しかとりえないこともあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3911-4 - 2015/03/04 (水) 09:41:48 - b 以前私がやりましたのはマウスの脾臓を砕いてsplenocytesに数種類のCD抗体で染色してフローしました。確かに細胞がフレッシュのまま解析まで持っていくのが理想なのはわかりますが、なかなか時間的体力的余裕がないのも非常によくわかります。だいぶ以前にやったことなので詳細なプロトコールは覚えていないのですが、脾臓の摘出から一次と二次抗体染色、洗浄し、最後サイトメトリーバッファーに1-2%のPFAを含ませて染色が終わった細胞を縣抱させ、冷蔵保存します。次の日にそのままサイトメーター室へ行って流して解析、と2日に分けて行いました。当時私も初めての実験でして、経験のあるラボで習った方法です。5回ほどこれでやったのですが、そのうち1回は染色がちょっとおかしかったのですが後はきれいに染まっていました。PBMCではやったことがないのですが、もしやってと言われたら同じようにやってみると思います。（二次染色までして固定、次の日にフローする。）上司の方は毎度フレッシュでやっていたのでしょうか。後は経験者の方のコメントを聞きたいところですね。サイトメーターやお使いの抗体のサポートさんにも聞いてみるのもいいかもしれません。練習できるサンプルがあるといいのですが、なかなか難しいでしょうか。あまりお役に立てず申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.3911-3 - 2015/03/04 (水) 08:49:01 - a b様 お時間いただきましてありがとうございます。 ご助言を参考に検索しましたところ、ホルマリンなどで細胞を固定する方法があるのですね。 現在私が使用しているプロトコルは上司の論文をもとにしており、細胞は毎時調製してフレッシュなものを使うことが望ましい(SLC,SSCの分布や蛍光強度などが変わってしまうため)と指示を受けているのですが、実際のところどうなのでしょうか? また、死細胞は分布が全く変わってしまうとも言われたのですが、固定(細胞を殺す)ことで影響はないのでしょうか? 質問を重ねて申し訳御座いません。 お時間御座いましたら引き続き宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3911-2 - 2015/03/04 (水) 02:50:59 - b 固定できそうですよね。抗体をつける前か後で。BDかお使いのサイトメーターのホームページや、直接会社に問い合わせれば標準的なプロトコールがありそうな気がしますが、どうでしょうか。

フローサイトに使う細胞の保存方法 削除/引用 No.3911-1 - 2015/03/03 (火) 14:38:29 - a 宜しくお願いします。 現在PBMCのフローサイトをしています。 採血→バフィーコート回収→溶血→CD抗体→標識抗体→フローサイト の流れで作業していますが、 採血場からの移動時間を含めるとかなり長時間になるため、 できればどこかのステップで実験を持ち越せるようにしたいです。 調製した細胞を凍結保存することをボスに提案しましたが、 現段階は、フローサイト実験系を立ち上げている最中なので、 凍結により細胞の状態や抗体のあたり方に通常状態と比べて 変化がでてしまうのでやめるように言われました。 にしても採血も他人の手を借りて行っているため毎回採血するわけにもいかず、 全血の状態で4℃で一晩保存したサンプルを試しに使ってみたところ、 その時用いたCD抗体に関して言えば特に違いはありませんでした。 当方はじめてのフローサイトなので、どのようにするのがベストなのか見当がつきません。 （凍結保存でもOK?、4℃保存?(4℃の場合全血だったら何日くらい、PBMCだったら何日くらい、保存はPBS?RPMI?)、それとも37℃で維持培養?、はたまたやはり毎時採血からやらなくてはダメ???） 経験を積んでいる先輩方でしたらどのようにするか、何卒ご教授ください。 宜しくお願い致します。

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