細胞周期の実験でDNA複製を阻害するめに、Gemininタンパクがほしいです。
大腸菌BL21DE3、IPTG添加で培養しておりますが、十分な発現量が得られません。
IPTG 0.1〜1 mM
37℃,2h or 18℃, O/N
といろいろふってみましたが、本来1〜5mg/ml得られるはずが、
0.037 mg/mlなど、2桁レベルの差があります。
ブロッティングして該当バンドの強さは確認しており、
間違いなく発現はしているようですが、とにかく濃度が低いです。
プラスミド自体は細胞周期のラボからもらいました。
論文にもなっておりおそらく問題ないです。
Gemininを使っている論文をいくつか見てみましたが、
どのグループも自分と同じラボからもらっているようで、同じ論文を引用していました。
ただ、どの論文も〜のやり方にしたがった...と引用のみで、詳細条件の記載はありませんでした。
実はプラスミドをいただいたラボからプロトコールももらったのですが、
十数年〜20年以上前のものだそうで、培養条件については、500 mlx2,
IPTG（濃度は記載なし）、37℃、2h cultureと書いてあるのみでした。
また、タンパク質の抽出はLN2 freeze<->thawを数回繰り返すという方法で行っております。
抽出法にも問題がありますでしょうか。
Gemininタンパク発現・精製のご経験がある方、また、一般に、タンパクの発現条件を
決めるときはこんな風に条件をふると良いなど、皆様のご経験を教えていただけると助かります。
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