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(無題) 削除/引用 No.3904-7 - 2015/03/01 (日) 20:59:25 - 名無し もし１回目のblotと2回目のblotでシグナルが重複（or 近接）するのでなければ、別にStrippingしなくてもいいのではないかと思います。てか、重複、近接しないような分子量の蛋白質を内部標準に選べばいいのではないかとも思います。もちろん、その辺ににextra bandが出ないことは一度はチェックしておくのは必要ですが。 beta actinの変化を調べることが目的の実験なのでしょうか。それとも内部標準にbeta-actinを選んだということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3904-6 - 2015/02/28 (土) 12:27:50 - おお あと、アクチンをmouseにするとかでベターな結果が得られる可能性があるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3904-5 - 2015/02/28 (土) 07:19:55 - モモ ストリッピングバッファーの組成はよく使われる 62.5mM Tris-Cl pH 6.7, 2% SDS + 2ME のやつですよね？ 室温30分では不完全だと思います。 60℃、30分ぐらいならかなり取れますが、さすがにアクチンなら少し残るかも。アクチンは最後がいいですよね。 ２次抗体は安くていくらでも手に入るので、普通は使いまわしはしないですよね。そのせいで実験を失敗することが一度でもあれば、そちらの損失のほうが大きいですからね。

(無題) 削除/引用 No.3904-4 - 2015/02/27 (金) 19:30:55 - AP 抗原抗体反応は不可逆反応ではないので、抗体反応のあとに抗体を含まない溶媒であらったり、別の反応液に入れれば一部は剥がれます。 >ストリッピング後に希釈した新しい二次抗体を使ったところバンドは検出されなかったので，抗体のの使い回しが原因だと思うのですが， 初回の一次抗体反応の後、いかによく洗おうとも二次抗体反応中に一次抗体が剥がれて混入するでしょう。それを次回に使い回したとなりゃ、豊富なタンパク質、感度の良い抗体であれば検出されちゃうでしょう。 一次抗体は自前で作ったり他所から分けてもらったり、市販品でも高価だったりロットに限りがあったりして、貴重であることが多いので、私も使い回しは良くします。しかし、二次抗体の使い回しは上記の理由でご法度です。二次抗体は買えば済むし、標識がヘタるのでケチケチ使うより毎回新しくして回転を早くしたほうがリーズナブルと思いっています。

(無題) 削除/引用 No.3904-3 - 2015/02/27 (金) 15:21:25 - おお いい抗体はstrippingでもなかなか外れてくれず、次のステップで検出されてしまったりすることはあります。 きっとstrippingが完全じゃないんだと思います。HRPはSDSなどでへんせいされてしまっているでしょうから、stripping後ECLには反応しないでしょう。ただ抗原に結合している抗体がのこっていたら、それに2次抗体ははんのうします。 アクチンなど強い抗体はなるだけ最後にやるといいかと思います。 strippingは強そうな条件ですが、b-MEをDTTにして加熱するさらに強い条件でやる人もいるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3904-2 - 2015/02/27 (金) 15:17:03 - TK-1 Stripping処理で、HRPが失活しただけで、抗体はまだメンブレンについているんでしょう。 ところで、actinなどの豊富にあって、いい抗体があるものをなぜ先に検出しようとするんですか。

ウェスタンブロットのリプローブについて 削除/引用 No.3904-1 - 2015/02/27 (金) 15:03:30 - もも 現在マウス臓器から抽出したサンプルをウェスタンブロッティング(以下ＷＢ)で解析しています。β-actinをAnti-β-Actin pAb-HRP-DirecT (MBL)でECLによって検出した後に，ストリッピングバッファー(1M Tris-HCl，10% SDS,2-MeEtoh，Milli-Q )を使用してβアクチンをはがしました（常温，30分）。ストリッピング処理後ECLでメンブレンから抗体がはがれていることを確認した後，1次抗体をオーバーナイトでつけました。その後HRP標識二次抗体（抗rabbit）をつけ，ECLで検出をしたところ，目的のタンパクと同時になぜかactinも発光していました。一次抗体，二次抗体ともに何度か回収し繰り返し使用しています。 どうしてこうなるのか検証してみようとストリッピング直後に二次抗体に浸してECLをかけたところ，β-actinが検出されてしまいました。どうしてこのようなトラブルが起こるのかわかりません。ストリッピング後に希釈した新しい二次抗体を使ったところバンドは検出されなかったので，抗体のの使い回しが原因だと思うのですが，古いのを使った際にどうして？なにがくっついてECLで検出されたのかわかりません。どなたか考えうる原因をご教授ください。

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