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(無題) 削除/引用 No.3901-17 - 2015/03/06 (金) 17:04:44 - loach 私達は予め分注、凍結乾燥しておいたものをDMSOを用いて1mg/mLに調製し、終濃度1ug/mL (DMSO 0.1%)となるように使用しています。 ただ、以下のページを参照して頂けるとわかりますが溶媒の自由度は高いですね。 http://www.scbt.jp/datasheet-201231.html DMSOを嫌い、かつラボ内で他にPGI2の使用者がいなければPBSよりTyrode's bufferの方がベターかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3901-16 - 2015/03/06 (金) 13:49:44 - platelet いろいろありがとうございます。とりあえずPGI2を試してみることにしました。PGI2の調整方法ですが、どのようにしたらよいのですが？PBSに溶解するだけでよいのでしょうか？教えてください。すみません。

(無題) 削除/引用 No.3901-15 - 2015/03/05 (木) 17:02:51 - loach PGI2は添加後速やかに（30 min程度）失活しますがPGE1はしばらく残ります。そのため、洗浄血小板調製後に刺激を加える必要がある場合に影響を受ける可能性があります。また、最後のTyrode's bufferにPGI2を加える必要が無いのは、その後トロンビンで活性化させる必要があると考えれば納得出来ると思います。 LさんのおっしゃるようにPRPをトロンビン刺激している論文は見たことがありますが実際には難しいように思います。日常的にマウス血小板を用いており、何通りかのPRP調製法を試しましたが、トロンビン凝集はうまくいきませんでした。PRPにはfibrinogenが大量にありますのでそちらで食われてしまっているのだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3901-14 - 2015/03/02 (月) 17:24:50 - L 私の場合PGI2は使いませんでした。他の実験では血小板の調整にPGE1を併用する場合もありましたが、ERKリン酸化を見る場合は、高速遠心時だけapyraseを入れ、最終的にタイロードにサスペンドする際には何も入れてなかったです。確か、PGsがERKリン酸化に影響する可能性を考慮してこのような形にしたように記憶していますが、実験的にPGsの影響を確認した事はありません。いずれにせよ、かなり昔の事で記憶が定かでないところもあるので、文献などで裏を取ってもらった方が確実かと（無責任モードですいません）。 あと、もし洗浄血小板で難しければ、PRPでやってみるのはどうかなと、ちょっと思いました。この場合は刺激後遠心してライセートにする事になりますが、この遠心で脱顆粒によるERKリン酸化がそれほど見られなければ、実験としては成立するような気もするのですが。

(無題) 削除/引用 No.3901-13 - 2015/03/02 (月) 16:53:35 - platelet ありがとうございます。高速遠心での活性化を防ぐとは、PRPを採取した段階でPGI2を添加して、遠心して血小板を採取するということですね。そして、Tyrodeに混和する段階ではもうPGI2は必要ないのでしょうか？トロンビンをその後加えた場合の影響などはいかがでしょうか？何度もすみません。

(無題) 削除/引用 No.3901-12 - 2015/03/02 (月) 11:01:55 - L １０年以上前になりますが、マウス血小板を用いてERKのリン酸化をウエスタンで見る実験をやっていました。ここ数年血小板の仕事はしてないので、現在の標準的な方法ではないかもしれませんが、当時のプロトコルでは、ACDの入ったシリンジにマウスの全血を採血し、低速遠心でPRPを得た後、1U/mlのapyraseを加えて高速遠心し、ペレットをタイロードに溶いてました。全行程を室温でやっていたと記憶しています。刺激はトロンビンではなくPAR4ペプチドで行い、刺激５分で強いERKのリン酸化が検出されました。刺激後は、遠心せず2x lysis bufferを直接加えてサンプルにしていました（細胞数はちょっと覚えてません）。凝集実験ではなかったので、撹拌はしませんでしたが、リン酸化ERKのウエスタンでは特に問題なかったように記憶しています。ちなみに、同じ条件でインテグリンの活性化（フィブリノーゲン結合）をFACSで確認できていたので、少なくともインサイドアウトのシグナルは入っていたと思います。 実験目的によりますが、トロンビン受容体を介したERKリン酸化を血小板で見たいだけならば、凝集させる必要はないかもしれません。凝集の過程で脱顆粒がおき、放出されたADPなどによるシグナルが混じってしまうかもしれません（お使いになっているトロンビンがワークしているかどうかの確認に凝集を見るのは良いとは思います）。皆さんおっしゃっているように、高速遠心の過程で活性化してしまっている事が原因のように思いますので、高速遠心時に何らかの阻害剤を入れる方が良いと思われます。一般論として、ERKが一度活性化するとnegative feedbackの経路が誘導されるため、その後の刺激は入りにくくなると思いますので。

(無題) 削除/引用 No.3901-11 - 2015/02/28 (土) 16:14:16 - pp モモさんと同じで私も凝集させるときは300ulあるいは100ulの系で回せる ガラス製のキュベット（スターラーバー入り）で1000rpmで回しています。 vortexでも凝集はすると思いますがイレギュラーな方法ですね。 おそらく洗浄血小板作製中に活性化してしまった場合、いざwesternのサンプルを 作ろうというときにすでにリン酸化が消失してしまっている可能性は十分あると思います。 モモさんの言うとおりゲルろ過が一番活性化せずに済む方法かとは思いますが 収量の問題や簡便さから私のラボではPGI2を使っています。 活性化するかどうかのチェックでしたら、うまく洗浄血小板ができていれば ”常温でタッピング”でも凝集します。 もしフローサイトができる環境であればPRPと洗浄血小板のスキャッタグラムを比べてみるといいと思います。 うまく洗浄血小板が出来ていればPRPと同じようなところに出てくるでしょうし、 活性化していれば肉眼では分からなくても微小な凝集塊は出来ているはずですから 出てくる位置が変わるはずです。 あと血小板活性化のマーカーとしてはマウスなら活性化インテグリンαIIbβIII抗体であるJON/AやP-selectinなどがありますがP-selectinは少しの刺激でも 出てきてしまうので不向きと言われています。

(無題) 削除/引用 No.3901-10 - 2015/02/28 (土) 13:50:02 - platelet 血小板をやっているのが私一人なので、血小板をいじる専門の機械もない状態です。それでディッシュでやる場合は静置、チューブならvortexを用いていました。vortexではだめですか？

(無題) 削除/引用 No.3901-9 - 2015/02/28 (土) 11:23:36 - モモ スターラーは使われていないのですね。 大昔に血小板をいじっていたことがありますが、スターラーで攪拌しながら刺激を入れていました。径1cmもないような細長いガラスの容器に太さ1mmぐらいのスターラーを使ってました。 刺激を入れて5分なら肉眼的な血小板凝集が起こっているはずの時間ですよね。 血小板を遠心で落とすときにはPGI2は使っていましたが、むしろゲルろ過でバッファー置換をしたほうが活性化せずに済むんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3901-8 - 2015/02/28 (土) 09:40:23 - platelet ありがとうございます。一応血小板を採取した状態ではチューブの中でもやもやした状態になっております。 トロンビンでの反応は、37℃でそのまま静置したり、37℃でvortexをかなり激しくかけたりいろいろやってみました。 30分から一時間休ませるということについては意識してはやっていませんが、細胞数を計測したり、いろいろしているうちに自然とそうなっていたと思います。これも37℃でやっていましたが、それで大丈夫でしょうか？ 確かに、トロンビンを加えてもいつもさらさらな感じでまったく反応が入っていない感じです。 あと、最初から活性化していた場合、PBSだけ加えたネガコンでもpERKが検出できると思うのですが、ネガコンもトロンビン加えたものもtotal ERKしかでません。（HelaにEGF刺激したポジコンではpERKが出ています。）そのあたりも教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3901-7 - 2015/02/28 (土) 08:18:48 - pp クエン酸だけの場合、全血やPRPのときは血小板活性化を抑制してくれますが、 血小板を遠心で落とす操作（うちでは2500rpm10min）においては不十分だと思います。 最終的な血小板懸濁液の状態で、ある程度血小板の状態を判断できます。 白濁していると思いますが、蛍光灯にかざしながら ゆるやかに転倒混和してみてください。 液が一様だったり、細かい粒子が見えるようならダメです。 モヤモヤ、キラキラした感じ（薄めの大腸菌液のような）ならＯＫです。 私のラボでは1100rpmまではクエン酸、その後PGI2を加えてから2500rpmで落とします。最後の懸濁液はタイロードのみでＯＫです。 また、うまく懸濁液ができてもすぐには使わず30分〜1時間室温で休ませた後実験に使用します。 westernのサンプル量ですが、total ERKが問題なく出ているとのことなので大丈夫とは思いますが、倍量くらいに増やしてもいい気がします。 血小板の濃度にもよりますが、50万、100万/ulという濃いめの濃度なら 1U/mlで凝集します。トロンビンを加えるとモヤモヤだった懸濁液が一様になり、 細かい粒子が見え始めどんどん粒が大きくなります。最終的には薄い黄色のゴロっとした塊になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.3901-6 - 2015/02/28 (土) 06:54:35 - モモ 確認ですが、スターラーで各藩しながら反応させているんですよね？

(無題) 削除/引用 No.3901-5 - 2015/02/27 (金) 20:57:40 - platelet ありがとうございます。最初に血液にクエン酸は入れているのですが。最後のTyrodeでの洗いや混ぜる段階にも入れておいた方がよいでしょうか？大体1mlにはどのくらい入れておいたほうがよいのでしょうか？ ピペットでgentlyにはできていなかったかもしれません。ただ、低温は避けて37℃で保管していました。 あと、total ERKのバンドはくっきりでていましたが、pERKのバンドが出ません。これでも血小板が最初から活性化していたからと考えたらよいのでしょうか？それともトータル300万程度の血小板を加えていただけなので、血小板数が足りなかったためなのでしょうか？ 最後に、トロンビンを加えた場合、血小板が凝集塊を作るのは、チューブ内で肉眼で確認できるのでしょうか？ すみませんが、教えてください。よろしくオン外します。

(無題) 削除/引用 No.3901-4 - 2015/02/27 (金) 19:01:56 - pp 血小板の研究をしております。 lysateをwesternする場合、一般的には30万〜50万plt/ulで1サンプル 50ulくらいあれば大丈夫だと思います。 IPとなるとより多くのサンプルが必要ですが。 トロンビンは0.5U/mlでも凝集しますから、2Unit/mlで活性化できないとなると 洗浄血小板のクオリティを疑います。 おそらくすでに活性化してしまっているのではないでしょうか。 洗浄血小板を作製するときはCa(-)タイロードに血小板凝集防止用の クエン酸やPGI2などを加えて活性化しないよう常に注意する必要があります。 それからピペッティングでのペレット懸濁もやさしくやらないと活性化してしまいます。冷やすのも厳禁です。 とりあえず50万〜100万plt/ulの洗浄血小板にトロンビンを加えてタッピングして 1分程度で凝集塊が形成されるなら大丈夫だと思いますがいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3901-3 - 2015/02/27 (金) 09:03:54 - platelet すみません。試料はマウスから採取した血液から重さの違いを利用して、遠心2回(11回転、5分)で赤血球を除去し、PRPを集めます。それを遠心(26回転、5分）で血小板を集め、Tyrode's bufferで洗い、それを遠心(26回転、5分）で最終的にTyrode's bufferに混ぜています。 トロンビンで刺激したのち、ERKリン酸化をWestern blottingで見たいのですが、うまく活性化がいきません。大体1サンプルに血小板数がいくら、血小板濃度なども含めてプロトコールを教えていただければと思っております。【現在、1サンプル3.0 X107個の血小板で実験し、最後に50µlのサンプルバッファーを加えています。）また、現在マウスの血小板で実験しておりますが、human plasmaのトロンビンを使っていますが、Bovineなど他の動物種を使うべきだなどあるのでしょうか？すみませんが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3901-2 - 2015/02/27 (金) 06:21:58 - おお あまり細かいことはわかりませんが、表面上それでいいようにみえますが、、、 そうすると試料の調製などの問題も視野に入れるべきかとおもえますが、その辺はあまり情報がありませんし。 サンプルバッファーにというのはいいんですが、それで一体何を見たのかもわかりませんし。

血小板のトロンビンなどでの刺激実験について 削除/引用 No.3901-1 - 2015/02/26 (木) 20:28:52 - platelet すみません。現在、トロンビンで血小板を刺激する実験を行っていますが、うまく活性化できません。具体的には、Tyrode's bufferに血小板を浮遊させ、終濃度2U/mlのトロンビンになるように加え、5 minインキュベーションを37℃でしたのち、1 min遠心して、沈殿にサンプルバッファーを加えています。どなたか血小板のトロンビンなどでの刺激実験の詳しいプロトコールを教えていただけないでしょうか？当ラボでは血小板を扱っているのは、自分だけでノウハウがなく困っています。よろしくお願いします。

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