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(無題) 削除/引用 No.3881-12 - 2015/02/24 (火) 08:00:04 - 中西部ポスドク qwさんが仰った通り、細胞を変えてみるのが早いと思われます。 www.proteinatlas.orgかゴルジが発達している分泌系細胞を片っ端からトライしてみるとよいかもしれません。膵臓ベータ細胞とか。

(無題) 削除/引用 No.3881-11 - 2015/02/23 (月) 15:34:44 - qw 内在性のタンパクAの何を見たいかによるとは、思いますが、 ＞なんとしても内因性タンパク質の発現をwesternで見れないかと考えています。 思いつくものがあるわけではないのですが、HEK293Tに限定しないほうが良いのではないでしょうか？調べれば、発現量の多い細胞株もあることでしょう。www.proteinatlas.org　辺りを調べると良いかもしれません。 それ以外に、ゴルジ局在を見たいのであれば、ウェスタンにこだわらなくとも、細胞の免疫蛍光染色も可能かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3881-10 - 2015/02/23 (月) 15:07:46 - おお Digitoninもけっこうじょうけんきめるのむずかしくないでしょうかねぇ、、、キットだと簡単そうだけどやはり最適条件は細胞や実験者の手で変わってくるし。かくステップを検証しながらやっていかないと、、、 Digitoninで膜に穴を開けた場合、チューブリンとかアクチンとかある程度重合したものや、リボソームなんかもけっこう細胞の中に残りそうですが、、、そうすると膜フラクションどの程度濃縮できるかなぁと、、、。

(無題) 削除/引用 No.3881-9 - 2015/02/23 (月) 14:49:09 - fj The proteomics Protocols Handbook 2005 Humana Press Inc. Edited by John M.Walker という本の第5章にも界面活性剤で細胞分画する方法が載っています。 Differential Detergent Fractionation of Eukaryotic Cells.というタイトルです。 多分、ミリポアのキットはこの方法を元にしているのではないでしょうか。 キットでない分、条件の変更が容易かと。 Digitonin/EDTA(0.015% digitonin, 5mM EDTA, 1mM PMSF, pH6.8)で細胞を可溶化したのちに遠心分離し、上清をCytosolicとし,ペレットをTritonX100/EDTA(0.5% TritonX-100,1mM PMSF,3mM EDTA, pH7.4)で可溶化し、遠心分離した上清を Membrane-organelleとして回収できます。

参考までに 削除/引用 No.3881-8 - 2015/02/23 (月) 13:30:48 - 中西部ポスドク 私が使っているキットの目的は違うのですが、何とか応用出来ないでしょうか？ ミリポアProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit 内容は明らかにはされていませんが、最初におそらくはdigitonin or saponinで細胞膜のみに穴を開け、細胞質を取り出して、その後通常のdetergentで膜タンパクの可溶化を行うようです。量を調節することによって（膜画分溶出のボリュームを減らす等）、少しは膜画分が濃縮されるような気がします。 ただし、超遠心でペレット化できるほうが圧倒的に効率はよい気がしますが。 もしくはFACSとか、染色とか。 もしくはIP-WBで濃縮出来る抗体があれば。

(無題) 削除/引用 No.3881-7 - 2015/02/23 (月) 13:04:58 - おお ゴルジは実際やったことはないので、核膜からのERにどの程度つなぎ止められいるものかというのが気になりますが、この辺は経験のある方のコメントがつくといいですね。

(無題) 削除/引用 No.3881-6 - 2015/02/23 (月) 13:01:06 - おお >「膜のなかにあるsolubleなもの」 ER lumen側にあるsolubleな蛋白。膜貫通ドメインをもたないサイトカインとか成長因子とかをいめーじしてました。言葉不足ですいません。

(無題) 削除/引用 No.3881-5 - 2015/02/23 (月) 12:54:45 - おお TX-114でGPIアンカーのついた膜蛋白を回収している例は見たことがあります。脂質の強い疎水的な部分を持っているような蛋白は成功率は高いかもしれません。膜貫通型の蛋白はおそらく大丈夫でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3881-4 - 2015/02/23 (月) 11:35:41 - GG おお様 大変興味深い方法論を共有してくださりありがとうございます。 「膜のなかにあるsolubleなもの」とは何だろう？と読んでいましたが、これは一番最後に書かれてある「膜に埋もれてなくて膜表面にあるやつ」のことを指されていますでしょうか？ 例えばGPIアンカー型タンパク質などでしょうか。 私の興味は、２種類のタンパク質の発現を確認したいです。 一つはgolgi/ERに局在する１型膜タンパク質、もう一つはgolgi/ERに局在するIII型膜タンパク質です。前者は一つ膜貫通領域を持ち、後者は2つ持っています。 低懲役でシリンジを使う方法は簡便そうですね。まずこれで行ってみようと思います。 TX-114を用いる方法、初めて聞きました。 Pierceの「Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Kit」のようですね。 自作してもいけそうな気もしますが・・やられた事ございますでしょうか？ 一度調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.3881-3 - 2015/02/23 (月) 10:19:59 - おお わたしは紹介したような方法で、membrane fractionはむしろ捨てている方ですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.3881-2 - 2015/02/23 (月) 10:15:56 - おお detergent(TX-100)なしで、低張液に細胞をけんだくして、 Potter-Elvehjemなどのhomogenizerで細胞をこわしてやるか、シリンジをつかいニードルに10回ぐらい通して細胞をこわすかして、1000gぐらいで核をのぞいた上澄み超遠心かけるといいかとおもう100000gで15分もあれば十分かと。超遠心の前に5000-6000gで10minぐらいえんしんするとミトコンドリアなどがいくらか除けるけど、ゴルジの挙動はちょっとわかりません。ゴルジを集めたいならシュークロースのdensityで上記で得られたcyto-membrane fractionを分ければいいんかなとそうぞうしてます。 まあ丁寧にやろうとするとマイルドな壊し方がいいですけど、超音波とかでこわしても、膜は回収できます。膜のなかにあるsolubleなものは丁寧にやらないと抜けてくるかもしれませんけど。 TX-100使ってもいいけど、脂質をflagment化だけして、溶解しないような濃度をみつけないと、膜が回収できないかもしれません。 ピアスに膜蛋白抽出用キットがあります。方法論的には、TX-114の入ったbufferで膜を溶解したあと、温度を40度とかにするとTX-114は水から相分離するので、ぶんりしてTX-114とそれに巻き込まれた疎水性タンパク質を遠心で回収するというものです。TX-114は下の相にきてsolubleなタンパク質は上の水相にきます。膜に埋もれてなくて膜表面にあるやつはもしかしたら、水相にくるかもしれません。

ゴルジ局在タンパク質の濃縮方法 削除/引用 No.3881-1 - 2015/02/23 (月) 09:48:41 - GG お世話になります。 トピックを立てさせていただきます。ご意見いただけますと幸いです。 現在ゴルジ局在タンパク質（仮にAとします。）について機能解析をしております。 このタンパク質は普遍的に局在するもので、得意的な抗体もサンタクルズより購入可能です。 ただ、このタンパク質の発現量そのものはかなり低く制限されており、上記抗体での検出はできませんでした。 Aのコンストラクトを作製し、HEK293Tにて一過性に発現させると、上記の抗体では検出されるのですが、filmにover exposeしても内在性のものは検出されません。 リバイス実験のため、qPCRだけでなくなんとしても内因性タンパク質の発現をwesternで見れないかと考えています。 これまでtotal cell lysateを最大で40 ug applyしましたが、検出されませんでした。 そこで、Golgiを含む膜画分を超遠心で濃縮し、それを解析できないかと考えています。 前のlabではN2 gasを用いたcabitationによりmembrane fractionsを回収していました。その後、Trinton X100でgolgi膜タンパク質（仮にB）の可溶化を行っておりました。 しかし、今のlabにはcabitation用の圧力をかける器具がなく、この方法は取れません。 そこで、低濃度のTriton X-100で細胞を軽度に溶解させ、その超遠心で濃縮出来ないかと思っています。 このような方法を試みられた方いらっしゃいませんでしょうか？ 界面活性剤の濃度や条件等を共有していただけますと幸甚に存じます。 特にGolgi膜だけの濃縮でなくても構いません。plasma membraneや他の小胞の膜の混入は問題ありません。 どうぞよろしくご教授いただけますと幸いです。

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