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(無題) 削除/引用 No.3871-9 - 2015/02/19 (木) 06:21:32 - おお GAPDHがかなり変動するという可能性はないでしょうか?ほかの興味ある遺伝子とかPCRでどの様な結果ですか?

(無題) 削除/引用 No.3871-8 - 2015/02/19 (木) 06:18:22 - yama ちなみに、泳動したところ、１８Sと２８Sはきれいバンドがでました。 不思議なことに、RNAがきちんと取れていると思われる検体と同じ濃さのバンドです。ということは、rRNAはきちんとふくまれているが、ｍRNAがうまくとれてないということかと思われます。

(無題) 削除/引用 No.3871-7 - 2015/02/19 (木) 06:06:31 - おお GFP蛋白はあんていだからねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3871-6 - 2015/02/19 (木) 04:02:40 - yama おおさん ありがとうございます。まだviabilityはチェックしてないのですが、この細胞は、レトロでGFPを強制発現させたもので、GFPはきれいに発現が持続していたので、細胞は元気だと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.3871-5 - 2015/02/19 (木) 03:41:56 - おお あと細胞のviabilityもチェックした方がいいかもしれません。確かに見た目の形態変化などでたいていの場合察しがつくとはおもいますが、あまり形態変化がなくほぼ瀕死の状態かもしれませんので。

(無題) 削除/引用 No.3871-4 - 2015/02/19 (木) 03:38:28 - yama おおさん ありがとうございます。 細胞はしっかりとPBSでwashしてから回収に供しています。 実際のRNA量というのは、吸光度の測定によるRNA濃度測定でしょうか？吸光度はほとんどでない状態となっています。質、分解という点では、RNA泳動してみようかと思います。ただ、10検体ほど同時にRNAを回収しましたが、バルプロ酸が加わっている検体のみに、このような現象が起こっているので、RNAの分解などに起因するものではないのかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3871-2 - 2015/02/19 (木) 03:22:56 - おお >[Re:1] yamaさんは書きました : > RNAeasy mini kit(DNAse処理も加えています)を用いてtoal RNA回収を試みたところ、バルプロ酸投与群においてはRNAがほとんど回収されていませんでした。これは、RNA濃度（濃度がほとんど測定閾値以下です）、RT-pPCRによるGAPDH測定で判断しました。何度か繰り返しましたが同様の結果です。 RT-pPCRによるGAPDH測定でRNA濃度が低かったと結論づけるには、根拠が乏しいです。問題解決のためにも実際のRNA量、同時に質(分解など)を確認してください。 細胞を回収するときにPBSで細胞を洗うとかしてますでしょうか?

バルプロ酸とmRNA回収 削除/引用 No.3871-1 - 2015/02/19 (木) 03:03:14 - yama いつも勉強させていただいております。 今、あるヒトのprimary culture細胞にバルプロ酸を投与する実験を行っていますが、奇妙な現象にぶちあたりました。 バルプロ酸2mMで細胞を7日間培養しました。control細胞と比較し、細胞死もなく十分量の細胞が問題なく培養できています。ところが、同検体を、RNAeasy mini kit(DNAse処理も加えています)を用いてtoal RNA回収を試みたところ、バルプロ酸投与群においてはRNAがほとんど回収されていませんでした。これは、RNA濃度（濃度がほとんど測定閾値以下です）、RT-pPCRによるGAPDH測定で判断しました。何度か繰り返しましたが同様の結果です。 control細胞ではきちんとRNAが回収できていること、十分な細胞数があることから回収系には問題ないと考えています。 どなたかこのようなご経験はございませんでしょうか？また何か原因をご存意の方いらっしゃられましたら教えていただけませんでしょうか？

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