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(無題) 削除/引用 No.3858-6 - 2015/02/16 (月) 01:01:41 - おお 再度こめんとありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3858-5 - 2015/02/16 (月) 00:02:25 - あかね Golden Gate reactionやGibson assemblyというクローニング方法の過程で、使っています。 いずれも複数のインサートを一度に挿入する方法で、反応過程で予期せぬインサートの並びでライゲーションされたり、中途半端な長さのインサートが入った場合は、環状プラスミドにならないので、直鎖状のDNAが産生されます。それらを除いて、環状な目的プラスミドだけを残すという目的でPlasmid Safeを使っています。Plasmid safe反応なしでもコロニーが沢山生えてきますが、当たりのコロニーの割合が低いです。成功率を上げたいときに使ってます。 なので、精製したプラスミドをいきなりPSで処理することはしていません。

(無題) 削除/引用 No.3858-4 - 2015/02/15 (日) 18:35:29 - おお monさん、あかねさん、コメントありがとうございました。 あかねさんも、精製したプラスミドをplasmid safeしょりして、邪魔なものを消化してから、制限酵素などできってっという作業で使っていらっしゃるのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3858-3 - 2015/02/15 (日) 18:22:40 - あかね plasmid safeって商品を使っています。 workしてますよ。

(無題) 削除/引用 No.3858-2 - 2015/02/15 (日) 13:39:39 - mon 主に、 サブクローニング前のベクター(精製済み）の処理に使っています。 NEB#4（Y-Tango)+1mM ATPにベクター ~5ug/50uL, 酵素1uLを加え、37℃ 15分、75℃ 30分処理して、NEB-HF酵素+SAPを添加し切断＋脱リン酸化させて、切り出し、かな。 self-ligation（切れ残り？）が激減するので、お勧めですよ。 なお、ligation後に使ったことはないです。 plasmid精製用のカラム中で使えないかなと思案中。

ATP-dependent DNase 削除/引用 No.3858-1 - 2015/02/15 (日) 13:11:30 - おお ATP-dependent DNaseを使っていらっしゃるかたいますか? ttp://www.epibio.com/enzymes/nucleases-glycosylases-dna-binding-proteins/dna-exonucleases/plasmid-safe-atp-dependent-dnase?details 一昔前に酵素が商品として出てきてなんかよさげかなぁと(なんでいいのかすらわすれてしまいましたが)おもったりしたのですが、、、もうわすれてしまっていました。 The enzyme has no activity on nicked or closed-circular dsDNA or supercoiled DNA。 とかいているので、ligationのあとに環状になってないDNAをこわして、ligationされて環状になったプラスみドを残すことができそうですが、、、

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