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(無題) 削除/引用 No.3854-9 - 2015/02/18 (水) 14:33:32 - mon APさん ありがとうございます。T5 exonucleaseが有効なのですね。 でも熱失活できないから制限酵素処理の前処理にはやや面倒ですね〜。

(無題) 削除/引用 No.3854-8 - 2015/02/17 (火) 22:59:07 - おお APさんわざわざありがとうございました。今読めないけど、、、よませていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3854-7 - 2015/02/17 (火) 20:13:56 - ｓｓ ふ〜。。

(無題) 削除/引用 No.3854-6 - 2015/02/17 (火) 19:37:53 - AP そのものズバリの文献にたどり着きました。 変性cccは通称"ghost plasmid"と言うようでこの語で検索すると多数のヒットがあります。 conclusiveな文献は ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269796903978 ghostを出さない条件検討 ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269708002248 ghostが正体不明だった頃と一番上の文献がでた直後のコラム ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968000494902089 ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000496300418

(無題) 削除/引用 No.3854-5 - 2015/02/16 (月) 11:54:48 - imasara むかーし、one cutやMCSでのみcutのベクターは、 切り出したところで切れ残りが排除できるわけじゃないから 意味ない、その上減っちゃう、ムダな作業でしょ？！ と言われて　そだなーと従ってましたが ・・・そんなことなかったんですねぇ・・T_T

(無題) 削除/引用 No.3854-4 - 2015/02/14 (土) 10:45:16 - おお 1ngで100はおおいですね。実際それぐらいコロニーが経験的には生えてきますか?お示ししていただいたブルーコロニーのれいとかで。 今後わたしも気をつけることにします。いずれにしろゲルから切り出した方がよさそうですね。さいわい切り出さないとうまくいかないというのは今のところ経験はしてない、、、とおもってますが、難しいconstructionもそれなりにこなしてきたつもりですが、正直言って切り出すことも多いので過去の経験からどうだったかよくわかりません。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3854-3 - 2015/02/13 (金) 16:16:42 - AP >10^8 cfu/ug plasmidのコンピならそれだけで10^4 cfuに相当します。 10^2 cfuでした。最初、100 ngベクターの例で書いて、書き直すときにヘタこきました。

(無題) 削除/引用 No.3854-2 - 2015/02/13 (金) 15:56:28 - AP だいぶ昔に、この現象の検証をしたブログがあって、そこで紹介されていた文献も見たはずなんですが、手元にコピーはありませんでした。 しかしながら、この現象は、プラスミド精製キットの説明書にあったり、ほかの文章にさらっと触れられていたりして、よく知られていることと思います。 例えば、qiagenの http://www.qiagen.com/jp/resources/faq?id=638413c8-482f-4423-a9b1-dbad7d513418&lang=en 制限酵素耐性については言及されていませんが、アルカリライシス法黎明期にアルカリ処理の条件検討を行った文献では"irreversibly denatured plasmid"と称されて登場します。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/ denatured plasmidの存在を知らなかった頃、ベクターを二重消化してもアルフォス処理しても青コロニーが結構出るなーというのはいつも経験していました。電気泳動のチェックでは完全消化されたリニアしか見えないので、二重消化の片側しか切れていないやつが混じっているんだろうとか、アルフォスは活性の弱い酵素なんだろう（実際は逆ですが）とか思っていました。 反応産物を少量、チェックのために泳動している分には見えないんですけれど、あるとき切り出しのために2-3 ugを泳動してみると、cccのあたりに薄いバンドが見えて、これはなんだ？ということで、いろいろ調べているうちに変性cccであることを知りました。また、アルカリ変性過剰で精製されたプラスミドは、チェックのために少量泳動してもcccがダブレットになって見えるほどで、インタクトな方は完全に消化するのに、変性した方は、酵素を足しても、一旦精製しないし手から消化しても全く切れない、ということも経験しました。 ベクターの切り出しをルーチンにするようになってから、青コロニーはほとんど生えなくなりました。 たいていは、チェックのために少量泳動しても見えない程度だと思いますが、マイクログラム規模で泳動すると、きっと多かれ少なかれ見えるでしょう。 EtBrの検出限界が1 ng程度ですから、1/1000量くらいは変性cccが含まれている と考えられますね。 1 ngのベクターでライゲーション、トランスフォーメーションをしたとすると、1 pgくらいは変性cccが含まれていることになります。 10^8 cfu/ug plasmidのコンピならそれだけで10^4 cfuに相当します。 たとえ、それを排除しなくても、目的のライゲーションプロダクトがそれ以上、悪くてもその1/10くらいはできていれば、目的の形質転換体を取るのも困難ではないでしょう。でも時として、回復培養した菌を全部まいても数個しか生えてこないような難度の高いコンストラクションもあります。そんな時に、変性ccc由来のコロニーが生えるのを許しては、取れるものも取れません。

変性ccc 削除/引用 No.3854-1 - 2015/02/13 (金) 10:34:15 - おお 変性cccの学術的記述がありますか?もうちょっとじょうほうがほしいとおもいました。いちどだけそれらしきことがありましたが、その時はかなり極端でなんかそう言うことがおこっているなぁとわかりました。のでそう言うことはあるのだろうなぁと漠然とした感じなので。

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