大変稚拙なトピックで恐縮ですが、どうかお力を御与え下さい。
現在、pHIV ZsGreenという空ベクターのHpa1サイトを用いて、遺伝子Aをサブクローニングしようとしています。
この空ベクター上にはいくつかの制限酵素認識サイトがあるのですが、遺伝子Aとの兼ね合いからHpa1サイトの平滑ライゲーションを利用するより他ないです。
クローニングの手順を説明させてください。
既に構築済みの遺伝子Aが乗った別のプラスミドを鋳型として、Pfu ヘラクレスにてPCRを行います。その後、ゲルから切り出し精製を行った後、T4 kinaseでリン酸化しました。
一方、pHIV ZsGreenの方は、Hpa1で消化後、QIAGENのQIASspin colomnで精製を行い、ロシュのRapid DNA Dephos & Ligation Kit を用いて、3 hrs, 37度で脱リン酸化させました。
その後、QIAGENのQIASspin colomnでphosphataseを除いた後、上記のPCR産物および、空ベクターを電気泳動を行い、bandのintensityから凡そvector:PCR productのモル比＝1:3を算出し、T4 DNA ligaseで30 min, R.T. その後4度冷蔵庫でover nightしました。翌日再度30 min, R.T.で放置した後、QIAGENのQIASspin colomnで精製を行い、その後、再度Hpa1処理（1 hr, 37度）しました。
その後、DH5alphaに形質転換し、コロニーをピックアップし、（コロニーPCRは全て陰性でした。）2 mlカルチャー後、Not1 cutで凡そ750 bpの切断産物は16のコロニー全てで確認できませんでした。
PCR productなしでHpa1処理したベクター単独のligationでコロニーがいくつでるか？はやらなかったのでわかりませんが、Hpa1で形質転換直前に処理しているのでゼロに近いと思ってやりませんでした。
このクローニングで約3週間ほど手こずっています。非常に情けない想いですが、自分が考えうるトラブルシュート全て行っても改善しませんでしたので、トピックをたてさせていただきました。
どうか不適切な箇所がありましたら、ご指摘いただけますと幸甚です。
どうぞよろしくお願い致します。 |
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