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(無題) 削除/引用 No.3853-28 - 2015/02/13 (金) 10:29:24 - おお > > ん、あっそうかベクターコントロールとってなかったのか、、、てっきり系が働いているとおもってました。 > でもあんまり困ったことはないんですよね。。。バックグランドチェックをして少ない状態になるようにligationの量を調整してるからかな。。。 あ、そうそうわたしは慎重にやるときはネガティブコントロールだけ先行してtransformationします。それでバックグランドの数を数えて、100ぐらいできるときは1/10のスケールで実際のtransformationをします。バックグランドが一桁ぐらいであれば、数十個できても、あ、入ったなとおもえるし、10個ぐらいしかできなくっても、調べるのは10個だけで、まあ入っていることは結構あります。明らかにbackgrandが高すぎるときは別ですけど。

(無題) 削除/引用 No.3853-27 - 2015/02/13 (金) 10:22:56 - おお >[Re:25] APさんは書きました : > >じっさい切れのこりのプラスミドはligationのあとのHpaI処理でつぶせるからわたしだったら、電気えいどうで切り出しすらやりません。 > > 切れ残るようなプラスミドは、変性して制限酵素に耐性になっているので、それでは潰せません。 ん、あっそうかベクターコントロールとってなかったのか、、、てっきり系が働いているとおもってました。 でもあんまり困ったことはないんですよね。。。バックグランドチェックをして少ない状態になるようにligationの量を調整してるからかな。。。

(無題) 削除/引用 No.3853-26 - 2015/02/13 (金) 10:16:44 - おお momさんが面白い提案をされてますが、わたしもその酵素を使ったことがあります。私の場合は挿入したい配列の端っこにその配列がありましたから、それを利用して末端にベクターの制限酵素処理で露出する酵素にあわせた配列がプライまーの末端にできるように設計しました。 constructionはいつもplan Bをあらかじめ用意しておいた方が無難です。なるべくなら平行してやると長引かないです。

(無題) 削除/引用 No.3853-25 - 2015/02/13 (金) 10:10:36 - AP >じっさい切れのこりのプラスミドはligationのあとのHpaI処理でつぶせるからわたしだったら、電気えいどうで切り出しすらやりません。 切れ残るようなプラスミドは、変性して制限酵素に耐性になっているので、それでは潰せません。

(無題) 削除/引用 No.3853-24 - 2015/02/13 (金) 09:41:22 - mon PCR primer は足場を長くして（12bpではなく）16bpほど長くなる、に訂正します。

(無題) 削除/引用 No.3853-23 - 2015/02/13 (金) 09:38:32 - mon PCR primerにTypeIIS酵素（切断部位が認識部位とずれている）の認識配列＋切断配列(=ベクターのREsite)を仕込んで、ベクターの2つのRE site間にligationする手法も良いですよ。 TypeIIS酵素としては、Bsa(Eco31I)I, BcoDI(BsmAI), BsmBI(Esp3I)が、4塩基 のcohesive endなのでベクターのMCSと組み合わすことが容易です。 この手法の良い所は、一方向性のLigationが可能、insert内部にRE siteがあってもベクターのRE siteを残せる、PCR産物はひとつの制限酵素で切断すればよい、など。 欠点は、PCRがprimerが長くなる（+12bpほど）ことかな。

(無題) 削除/引用 No.3853-22 - 2015/02/13 (金) 09:08:41 - おお >[Re:20] Robさんは書きました : > 脱リン酸化スキップですか・・非常に怖いですが・・行ってみます。 > やはりPCRプロダクトのようなdsDNAよりプライマーへのリン酸化反応の方が効率は良さそうでしょうか。 一般的にそういわれてます。まあでも10%ぐらいリン酸かしてくれれば、ちゃんと取れるでしょうけどね。ベクターを脱リン酸かしなければ、insertの末端のリン酸かはなくても入るわけだし、あったほうがましというかんじかな。 非常に短いPCRプロダクトだと、脱リン酸かしてないベクターにselfがおさえこまれるほど大過剰のinsertを入れてligationして、とるひともいます。でもこれはブラントだったらもしかしたらちと厳しいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3853-21 - 2015/02/13 (金) 09:01:09 - a ゲル切り出しのときのUVは大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3853-20 - 2015/02/13 (金) 08:57:26 - Rob おお様 何度もありがとうございます。 コンストラクトを作る前にソフトでできたものを作って制限酵素サイトなど全てチェックしていますので、ligation後にHpa1サイトが壊れない可能性や、insert中のHpa1サイトが無いことは確認しています。 脱リン酸化スキップですか・・非常に怖いですが・・行ってみます。 やはりPCRプロダクトのようなdsDNAよりプライマーへのリン酸化反応の方が効率は良さそうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3853-19 - 2015/02/13 (金) 08:55:42 - おお じっさい切れのこりのプラスミドはligationのあとのHpaI処理でつぶせるからわたしだったら、電気えいどうで切り出しすらやりません。

(無題) 削除/引用 No.3853-18 - 2015/02/13 (金) 08:53:15 - おお >vectorの制限酵素処理/脱リン酸化処理後 脱リン酸化スキップしてみたら、 ligationごHpaI処理するんだったら。 あとプライまー末端とベクターがligationしたときにまたHpaIサイトができるっていう落ちがないかかくんにしてみて。

(無題) 削除/引用 No.3853-17 - 2015/02/13 (金) 08:48:58 - Rob おお様 ありがとうございます。 T4 kinaseはつい先日inverse PCRで利用しましたので、使えていると思います。購入したばかりでもありますし。kinase bufferも新しいものを使用したのでATPの分解が理由ではないのかなと思いたいです。 PCRの条件は比較的きつめにしています（アニーリング温度） ミニプレップの印象からLTRの組替えなどそういうことが原因（大腸菌との相性）なのかもしれないです。。一度ここでご指摘いただいた、vectorの制限酵素処理/脱リン酸化処理後に切り出しを行うことと、コントロール（ベクターのみ）ligation plateを作ることにしてみます。 それでもだめなら大腸菌のホストを変えることも考えて行きます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3853-16 - 2015/02/13 (金) 08:48:16 - おお >> ２．リン酸化はプライマーの状態で行なったほうが効率がいい。 >僻地にいるため、プライマーを発注し直すと7 daysから1 wkかかりますので、今あるものでまずトライしようと色々していたのですが、３週間も経ってしまい恥ずかしい限りです。 酵素があればご自身でできますよ。

(無題) 削除/引用 No.3853-15 - 2015/02/13 (金) 08:39:52 - Rob 774R様 沢山ご指摘いただき、感謝しております。 > １．ベクターは泳動後切り出し精製を行なうべき。 これに関しては、他の方からもご指摘いただきました。これまでしなかったのは運が良かっただけなのかもしれませんね。また平滑ライゲーションということもあり、効率が悪いことがより一層困難にしていたのかもしれません。 > ２．リン酸化はプライマーの状態で行なったほうが効率がいい。 僻地にいるため、プライマーを発注し直すと7 daysから1 wkかかりますので、今あるものでまずトライしようと色々していたのですが、３週間も経ってしまい恥ずかしい限りです。 > ３．コントロール実験として、ベクターのみ、ベクター＋リガーゼの２通りを確認してください。 これに関してもきちんと確認します。 > ４．ダメなときはベクターの元になるプラスミドのミニプレップからやり直す。元が悪いと、どうしても切れ残りが出てきます。ゲルで目視できないレベルでも大量のコロニーになって出てきます。 今回はこれを行っておりました。 > ５．できれば平滑末端のサブクローニングなんかデザインしない。 > ベクターに適当な制限酵素サイトがない場合は、そこを改変してもいいと思います。後々、便利ですよ。やり方は、改変したい配列のオリゴをセンスとアンチセンスを合成して、ベクターの適当なサイトに入れるだけです。ほぼ100%当たりがとれます。 そうですね。MCSを変えたり、tagを挿入したりはしているので、後々の事を考えて行うことも視野にいれるようにします。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3853-14 - 2015/02/13 (金) 08:14:49 - Rob p様 前に別のプラスミドを作っていた際に、その方法でEcoR1を平滑化してligationを試みた事があるのですが、うまくいかず、別の方法をとったことがあり、今回はその方法を見送っていました。 もう少し今の方法で試してみて、それでもダメならご指摘いただいたより理論的には確実性がより高いその方法でトライしてみます。 う様 ２つのサイトを用いてクローニングすることを毎回しているのですが、今回に限ってそれができず、しかも平滑でのライゲーションしか選択できませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3853-13 - 2015/02/13 (金) 08:11:48 - Rob AP様 同じ移動度との事、了解しました。ありがとうございます。 昨日見にプレップして、インサートが入っていない事を確認しつつ、12個中、半分がプラスミドの全長が極端に短くなっているものが取れてきました。LTRを含むベクターですので、LTR間の組替えを想像しますが、やはりDH5アルファよりも、特化した大腸菌の方がいいのかなとも思っています。 なのでコロニーを生やした理由として、 制限酵素で切れない変性cccが形質転換したものと、オリジナルのベクターのLTR間で組替えを起こし、Hpa1サイトを失ったためHpa1 resistantになったものも含まれてくるのだろうと想像しています。 ですが、まず、ご指摘いただいたようにゲルから切り出しは必須という意識を持って再度挑んでみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3853-12 - 2015/02/13 (金) 07:29:25 - AP 変性cccはintact cccとほぼ移動度は同じです。バンド1本分くらい速く移動するくらいでしょうか。 脱リン酸したのにセルフライゲーションの形質転換体がでる、、、というときは実はこいつが原因です。

(無題) 削除/引用 No.3853-11 - 2015/02/13 (金) 06:07:56 - Rob AP様 はい、ご指摘いただきましたように、制限酵素処理後にベクターのゲル切り出し精製はしていませんでした。変性cccのこと、恥ずかしながら初めて知りました。変性cccが存在するとのことですがこれは制限酵素でカットされたリニアなものとアガロースゲル電気泳動上で区別できますでしょうか？もちろんゲル切り出しはなるべくバンドのみを切り出すようには気をつけようとは思いますが・・ 774様 やはり、ベクター単独のコントロールは必須でした。慢心があったのだと思います。 言い訳がましいのですが、今回のようにHpa1などでligation直前にカットできるような場合には必ず目的のものと、insertが反対に挿入されたものが50:50で取れると思っておりました。ただ、このような処理が出来ない場合には必ずベクター単独をコントロールには置いていました。 次回、きちんとネガコンを取ってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3853-10 - 2015/02/13 (金) 04:14:14 - おお そんな馬鹿なと思えるのですが、そのinsertにHpaIサイトがないですよね、、、あるいはSNPsや持っているとかプラスみどに入っているものがmutationを持っているとか入ったとか、、、

(無題) 削除/引用 No.3853-9 - 2015/02/13 (金) 04:06:22 - おお > PCRってスペシフィックなバンドとして認識できてもなんかノンすぺとか潜んでないかとかいろいろ、微量だけどわるさするようなproductができてないかとかあるんじゃないかって思っちゃうんですよね。それかミスアニーリングでうまく2本鎖になってないようなかんじで末端がうまくそろってないとか、、、いろいろなことがおきてるんじゃないかと妄想してしまいます。 まあそんな懸念があるのでPCR Productsをベクターに入れるときはPCR productsの収量がおちても(若干落ちるぐらい)厳しい条件でPCRするのがいいんじゃないかという話をしますし、心がけています。

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