全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3850-4 - 2015/02/12 (木) 21:49:07 - 小児科医師（ゆとり教育） seven様、~様、コメントありがとうございました。 やはり混合、遠心は原因として考えられないですよね。本日、再度、同じcDNAを用いて同じプライマーを使って、実験前に混合、遠心をしてreal time PCRを行ったのですが、今回は96個のサンプルできれいに増幅曲線の立ち上がりが見られました。ちょっと原因はわかりませんが、毎回、混合・遠心して悪いことはないのでそうすることにします。

(無題) 削除/引用 No.3850-3 - 2015/02/12 (木) 15:09:39 - ~ どういう操作をされているか分かりませんが、分注操作のミスもありうるのではないでしょうか。 どこかのステップで液量を目視で見られましたか？ ・96サンプルの逆転写溶液を96ウェルプレート等に入れていて、冷蔵庫にしまう際にぶつけて、液が上の方に来ていたor液の下に空気の粒ができていたため、分注時に空気を吸っていた ・8連マルチチャンネルピペット等で分注した際に、チップの刺さりが悪くて8uLを吸い取れなかった

(無題) 削除/引用 No.3850-2 - 2015/02/12 (木) 10:27:19 - seven 基本的に使用前はボルテックス、スピンダウンしているので影響度合いはわかりませんが、冷蔵庫保存の場合は蒸散、結露でフタに残っている場合もあるのでその分の影響は出てきます。 ただし、出ていたピークがでなくなるレベルだと、濃度が少し変化したというよりは何百、何千分の一にまで減少しているように思います。 PCRmixに問題がないとすれば逆転写がうまくかかっていない、DNaseのコンタミによるcDNAの分解とかでしょうか。おなじcDNAを使って以前にうまくいったなら分解のほうがあやしいかもですね

DNA、 RNA溶液は毎回、混合・遠心すべきか 削除/引用 No.3850-1 - 2015/02/12 (木) 02:40:35 - 小児科医師（ゆとり教育） 先日、96well plateでreal time PCRを行ったところ、96サンプル中、3つのサンプルで増幅曲線の立ち上がりが見られませんでした。それらのサンプルは、以前、他の遺伝子でreal time PCRを行い、cDNAが含まれていることは確認できています。普段のreal time PCRではすべてのサンプルで立ち上がりが見られることが多いです。 立ち上がりがみられなかった原因を考えているのですが、PCR mixとcDNAの混合はしっかりとできていると思います。PCR mix (12ul)に対し、8ul (5ng/ul)のcDNAを加え、10回ほどピペッティングして混合しています。他のサンプルのCT値は20-22だったので、PCRがかかりにくい種類のものではなく単純にPCRが失敗しているのだと思います。 思いたることとして、前日にcDNA溶液の入ったチューブをボルテックスにて混合、遠心したので、改めて混合するのを怠ったのですが、それが立ち上がりがみられなかった原因として考えられるでしょうか？cDNAなのでそんなにDNA長が長いわけではないですし、特に凍結したわけでもないのに溶液中で濃度差がでるのも考えにくいように思うのですが、他に思い当たる原因も思いつきません。 そこで質問なのですが、DNA溶液やRNA溶液が4度で保存してあり、前日（もしくは実験の数時間前）に混合、遠心してあった場合、改めて混合、遠心をする必要はあるでしょうか？ 御意見賜りますと幸いです。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---