Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

未知の塩基配列のクローニングについて トピック削除
No.3846-TOPIC - 2015/02/10 (火) 19:47:53 - tora
初めて投稿させていただきます。

早速ですが、未知の遺伝子配列のクローニングについてです。
イヌのchromograninA(CgA)の遺伝子をクローニングしたいのですが、既にCgAの遺伝子が知られている他の数種類の動物の遺伝子を参考にして、相同性の高い部分の塩基配列を参考にしてプライマーを作製し、クローニングするように言われています。最終的には、リコンビナントタンパクの作製が目標なので、フレームシフトについても考慮するように言われました。

ここで質問なのですが、１.相同性の高い配列を参考にしてプライマーを作製することは可能かどうか(実際に行われているかどうか）と、2.未知配列のプライマー作製においてフレームシフトを考慮できるかどうか、3.5'/3'RACE法以外に未知領域の塩基配列をクローニングする方法があれば、教えていただきたいです。
質問が多くて申し訳ないですが、少しでも分かることがあればよろしくお願いします。
乱文、拙文で失礼いたしました。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.3846-6 - 2015/02/15 (日) 04:58:44 - おお
そういえばクロンテックが溶液中でハイブリしてアニールしたものをプルダウンしてクローニングするというsystemのキットをだしてたな。

(無題) 削除/引用
No.3846-5 - 2015/02/14 (土) 13:39:40 - tora
皆様
解答ありがとうございます。
皆様のアドバイスを参考にして、プライマーを作製していこうと思います。

(無題) 削除/引用
No.3846-4 - 2015/02/11 (水) 00:42:59 - おお
プライまーをつくってPCRフラグメントをえたら、まずは配列を読んでいって配列を決めたらいいと思います。同一動物ゲノム内にも、その遺伝子がファミリーで存在したり、目的の遺伝子いがいにもその配列によくにたシュードgeneがある可能性もありますので、その辺を考慮して方法を練ってください。
まあ、本当にgenome 配列がないばあいですが。

(無題) 削除/引用
No.3846-3 - 2015/02/10 (火) 21:31:43 - AP
イヌの事情はよく知りませんが、全ゲノムの解読は終わっているんですよね。in silicoで適当なプライマー配列は設計できるんじゃないですか。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/976

そりゃ前世紀の末期くらいには近縁種の配列やアミノ酸配列からdegenerate primerを設計して遺伝子をpcrでクローニングするという仕事はよくやられていましたが。
一つのアミノ酸に対する複数のコドンをカバーできるように異なるコドンの混合にしたり、適宜デオキシイノシンをいれたり、プライマー3'末端が揺らぎの少ないコドン2塩基目になるようにしたり、確立されたテクニックがあります。成書を調べれば出ているとおもいます。molecular cloningの第3版には簡単ながら解説がありました。

(無題) 削除/引用
No.3846-2 - 2015/02/10 (火) 20:43:33 - mon
１.相同性の高い配列を参考にしてプライマーを作製することは可能かどうか(実際に行われているかどうか）。
1980-90年代かな？多くの遺伝子で報告があります。成書もあります。
2.未知配列のプライマー作製においてフレームシフトを考慮できるかどうか。
プライマー作製においてではなく、クローン化したあとDNA配列だけでなく（推定）アミノ酸配列でも比較を行い、クローニングエラーによるフレームシフトがないことを確認しなさい、という意味だと思います。指導者に聞いてください。
3.5'/3'RACE法以外に未知領域の塩基配列をクローニングする方法
classical:ハイブリダイゼーションによるcDNAクローンのpick-upなど。
in silico:イヌのゲノム配列、推定cDNAから
というか"chromogranin+dog"で検索すると出てきますよ。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=chromogranin+dog
品種によって多型はあるでしょうから、1対のprimer対で増えない場合は場所をずらして作製してください。CDS長によっては全合成が早いかも。

未知の塩基配列のクローニングについて 削除/引用
No.3846-1 - 2015/02/10 (火) 19:47:53 - tora
初めて投稿させていただきます。

早速ですが、未知の遺伝子配列のクローニングについてです。
イヌのchromograninA(CgA)の遺伝子をクローニングしたいのですが、既にCgAの遺伝子が知られている他の数種類の動物の遺伝子を参考にして、相同性の高い部分の塩基配列を参考にしてプライマーを作製し、クローニングするように言われています。最終的には、リコンビナントタンパクの作製が目標なので、フレームシフトについても考慮するように言われました。

ここで質問なのですが、１.相同性の高い配列を参考にしてプライマーを作製することは可能かどうか(実際に行われているかどうか）と、2.未知配列のプライマー作製においてフレームシフトを考慮できるかどうか、3.5'/3'RACE法以外に未知領域の塩基配列をクローニングする方法があれば、教えていただきたいです。
質問が多くて申し訳ないですが、少しでも分かることがあればよろしくお願いします。
乱文、拙文で失礼いたしました。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。