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(無題) 削除/引用 No.3843-21 - 2015/02/13 (金) 10:43:34 - ~ >脱リン酸化処理に問題があった（時間が短い？）、切り出しの際に脱リン酸化されていないベクターが混入した、といったことが原因なのでしょうか？ トラブルが続いているときは、 �@ベクターのみ、ライゲーション無 　→切れていないベクターのみ増える �Aベクターのみ、ライゲーション有 　→�@＋脱リン酸化されていないベクターが増える �Bベクター＋インサート の3条件でトランスフォーメーションしておくと、 ベクター側のどのステップにトラブルがあるかが判別できます。

(無題) 削除/引用 No.3843-20 - 2015/02/13 (金) 10:37:31 - iwa さくさん 理解できました。ありがとうございます。 皆さんがご指摘くださったように、切り出し後に濃度測定を行い、かつheat inactivationを行わないというストラテジーをとったところ、これまで数個しか出てこなかったコロニーが50個くらい出てきました。 喜んで16コロニーからプラスミド抽出を行ったのですが、すべてハズレでした。 脱リン酸化したにも関わらず、セルフライゲーションした元のベクターが入っていました。 脱リン酸化処理に問題があった（時間が短い？）、切り出しの際に脱リン酸化されていないベクターが混入した、といったことが原因なのでしょうか？ ゴールに近づいたと思ったのですが、まだまだのようです。

(無題) 削除/引用 No.3843-19 - 2015/02/13 (金) 09:05:10 - さく CIAPした後ゲルで切り出さずにそのまま精製して、精製後にライゲーションに使ったら良いです。ゲル切り出ししないだけで、精製は必要です。

(無題) 削除/引用 No.3843-18 - 2015/02/12 (木) 19:33:43 - iwa 774さん 私の勘違いが原因でした。申し訳ありません。 頑張りたいと思います。 さくさん コメントありがとうございます。 切り出ししないというのは、CIAP処理したベクターをそのままライゲーション液に加えるということでしょうか？ どうしてもうまくいかない場合、ベクターの再調整および菌株の変更を行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.3843-17 - 2015/02/12 (木) 17:32:00 - さく ベクターを切り出した後、濃度測定はされたほうが良いです。上手く行っていないならなおさらです。10kbpを超えるとゲルからの回収率が50%切ることは往々にしてあります。手順等にもよるので一概には言えませんが。CIAPがちゃんと動いているようなら、切り出ししないのも一案です。 あと、色々トラブルシューティングもやったのに何で上手くいかないか分からなかった時、ベクターが無くなりそうになってベクターを調製しなおしたらあっさり上手く行ったというよく分からない事が起きたことはあります。未だに謎です。大腸菌株を変えたらうまくいった事もあります。 頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.3843-16 - 2015/02/12 (木) 16:31:15 - 774 iwaさん 皆さんのご指摘通り、操作の目的を勘違いしてました。 混乱させてしまってたらすみません。 実習頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.3843-15 - 2015/02/11 (水) 00:25:58 - iwa 中年さん、ご回答ありがとうございます。 バッファーは毎回交換しています。 UVの代わりにLEDを当てています。

(無題) 削除/引用 No.3843-14 - 2015/02/11 (水) 00:19:22 - 中年 必ずしも等モルで泳動する必要があるわけではなくて、バンドの明るさ（濃さ）からマーカーのバンドの明るさを指標に濃度を（大まかに）計算し、それを断片の長さで割ることでモル濃度の相対値がわかるはずだと言いたかったのです。 それはともかく、最初に書いたように、CIAP処理無しのセルフライゲーションしたベクターのトランスフォーマントが1000以下というのはいくらなんでも少なすぎると思います。ゲルからの切り出しに際しては、泳動槽はきれいに洗ってバッファーも新しいものを使っていますか（バッファーの使い回しをしていませんか）？ＵＶを当てないでどうやって切り出しをしていますか？

(無題) 削除/引用 No.3843-13 - 2015/02/11 (水) 00:07:59 - iwa qwさん、ご回答ありがとうございます。 XbaIの周辺配列については確認しており、メチル化で切れないということはないはずです。 0.7%ゲルを用いる理由についても分かりやすく教えてくださり、ありがとうございます。 よく理解できました。 こちらも、試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3843-12 - 2015/02/10 (火) 23:49:20 - qw XbaIの周辺配列がDamメチル化で切れなくなっている可能性はないだろうかということです。切れていなければ、インサートをライゲーションすることは不可能ですから、XbaIでベクターがちゃんと切断できていることを確認するほうが宜しいということです。 gaTCTAGA やTCTAGAtcになっているDNA配列は、大腸菌の中でメチル化されるので、XbaIでは切れないのです。 ゲルの濃度の件ですが、制限酵素で切断していない13kbpのベクタを泳動すると、きっと8kbpと14kbp辺りにバンドが出ますよね。14kbp付近のバンドはopen-circular DNAといって、ニックが入っているDNAだと言われています。１％ゲルでsingle-cutの13kbpバンドを切り出すときに、このopen-circularの切れていないDNAも一緒に切り出している可能性があるよね。ということです。 ゲルを薄くすると、ある程度13kbpと14kbpが分離できるかもしれないから、何もわざわざ１％ゲルで流すことはないだろうと思います。 open-circularのDNAが混ざっているとライゲーション無しでtransformされますから、CIAPなしのコントロールが理解不能になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3843-11 - 2015/02/10 (火) 23:14:40 - iwa 中年さん、APさん、qwさん、ご回答ありがとうございます。 heat shockとheat inactivationを混同していました。 確かに、NEB ligationのプロトコルにもheat shockではなくheat inactivationと記載されていました。 DNA抽出ですが、NaIとグラスミルクを用いています（一般的なものなのだと思っています）。 泳動は、同モルでバンドの明るさを比較したことがありませんので、比較してみます。 少なくとも、vector側でバンドが2個確認されたということはありませんが、こちらも念のため意識しておきます。 質問ばかりで恐縮ですが、ゲル濃度を低くして切り出すと、どういった利点があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3843-10 - 2015/02/10 (火) 22:42:06 - qw ベクターが本当にXbaIで切れていることも確認していおいたほうが良いだろうと思います。例えば、XbaIから数キロ離れたところで、もう一箇所切断して、バンドを2つ確認できるとか、です。 13kbpのDNAを1%アガロースで切り出すのは、ちょっとやだなと思います。私であれば、0.6-0.7%程度に低くして、泳動します。

(無題) 削除/引用 No.3843-9 - 2015/02/10 (火) 18:51:33 - AP 42度、1分は、プラスミドをコンピーテントセルに混ぜてから取り込みを刺激する操作のこと。これが一般的にヒートショックといわれているので、勘違いをされただけ。 ライゲーション後の60度、10分は酵素を失活させて反応停止する操作。これはやる必要ないという話。この操作は熱失活とかheat inactivationとか呼ばれるけれど、ヒートショックは一般的ではない。世界の何処かではそう云うのかもしれないけれど。ちなみにBigDyeの説明書で熱変性、heat denatureのことをヒートショックと称していて、ものすごく違和感がある。

(無題) 削除/引用 No.3843-8 - 2015/02/10 (火) 18:47:12 - 中年 「42C, 1min」はトランスフォーメーションのためのヒートショックの話なので、そのステップには当てはまりません。熱失活のステップは不要だと思います。 バンドの明るさをみてDNA濃度をおおまかに見積もることは普通に行われています。それを行わずに、13kbのベクターと1.3kbのインサートのいずれも50%の収量だと仮定しているとすると、問題はそこかもしれません。ゲルからのDNA抽出の方法にも依りますが、汎用されている方法の多くはDNAが大きくなると収率がぐっと悪くなります。同じモル数だと、エチジウムブロマイド染色したバンドの明るさ（濃さ）はDNA断片の長さに比例するはずですが、そうなっていますか？

(無題) 削除/引用 No.3843-7 - 2015/02/10 (火) 18:40:40 - iwa 774さん、中年さん、~さん、ssさん、ご回答ありがとうございます。 こんなに情報を頂けるとは思っていませんでした。 何とか成功させたいので、頑張ります。 ヒートショックですが、用いているNEB T4 Ligaseの失活のために行っています。 プロトコルに「16C, over nightの後に60C, 10minでヒートショックをして、その後にtransformation」と書いてあったので、特に気にせずそのまま実験していました。 「42C, 1min」および「ヒートショック不要」というご意見を頂いたので、どちらもtryしてみます。 ベクターとインサートですが、モル比で1:1, 1:3, 1:10としています。 電気泳動でそれぞれのバンドが目的の位置に出ているのは確認しました。 濃度は測定していませんが、ゲル抽出の過程で半分失われると教えてもらったことがあるので、それに基づいて計算しています。 基本的な質問なのですが、バンドを見るだけでおよその濃度を推定できるのでしょうか？ コンピタントセルは、東洋紡のCompetent Quickを使用しています。 完全にプロトコル通りに行い、10min程度でtransformationを完了させています。 研究室にはCompetent Highというのもありますが、こちらは使用したことがありません。

(無題) 削除/引用 No.3843-5 - 2015/02/10 (火) 14:07:48 - ss 研究室配属の実習ということなので、与えられている材料やプロトコールが決まっている中での改善法ということですね。 すでに指摘がありますが、ligationからtransformationの過程での問題だと思います。 ベクターとインサートの比率をモル比で計算しているかをまずは確認することと、ligation後に熱処理せずそのままtransformationに用いることで解決できるように思います。 ligation後の熱処理はいわゆる形質転換時のヒートショックではなくligaseの失活が目的だと思いますが、多くのligaseでは必要ありませんし、ものによっては形質転換効率を下げる要因になります。

(無題) 削除/引用 No.3843-4 - 2015/02/10 (火) 13:50:29 - ~ ●はずれとは？ はずれとは、ベクター側のセルフライゲーション（または切れ残り）でしょうか？ それとも、違うものでしょうか？ 取れているものが何かで、何が起きているかを予想しますので、 はずれが何かはトラブルシューティングでは重要な情報です。 ●DNA断片のチェック 各DNAの濃度は電気泳動で確認していますか？ バンドを見ておくと現物があることが出来て安心できます。 ●コンピタントセルの形質転換効率 使っているのは市販品でしょうか？ 自作であれば、no cutのベクターで形質転換効率を確認しておくと、 コンピタントセルの質が悪いことが原因かが分かるでしょう。 ●ヒートショック条件 これは相手に伝わりにくい記載だと思います。 この位置に記載するということは、ライゲーションが終わったサンプルを ヒートショックし、その後で大腸菌と混ぜたのですか？ そうだとすると、何のための操作でしょうか？ そうではなく、温度条件からすると、「ライゲーション前にDNAに熱をかけて、 突出末端を露出させる」が目的で、ライゲーション前に処理しているのだと 思いますが、記載の位置がおかしくありませんか？ ●形質転換の操作の中身 形質転換の操作や、その後の操作が全部省略されていますが、 そこには問題がなく、相談する必要がないのですか？ プロセスに問題がないのかを聞いているのですから、 どういうプロセスで操作しているのかは伝えないといけないでしょう。 ●トラブルが長期に渡る場合 数日で解決できるのであればやる意味はありませんが、 もし2週間を超えるような場合は、 ・数百bp位の両末端がXbaIのフラグメントを用意して、ベクター側に入れてみる ・pBluescript等をXbaI処理したものを用意して、インサート側を入れてみる を行い、問題があるのがベクター側か、インサート側化の確認をするといいかもしれません。 片方に問題があることが分かれば、そちらの調整法等に注力できます。

(無題) 削除/引用 No.3843-3 - 2015/02/10 (火) 13:03:07 - 中年 XbaI処理のセルフライゲーションでコロニーが1000個以下というのは、形質転換効率が低すぎる気がします。 精製後のベクターとインサートの一部を電気泳動するなどして、どのくらいの濃度あるか調べていますか？

(無題) 削除/引用 No.3843-2 - 2015/02/10 (火) 12:59:20 - 774 ヒートショックは４２℃、１min くらいでいいのでは？

単一の制限酵素を用いた場合のライゲーションとサブクローニング 削除/引用 No.3843-1 - 2015/02/10 (火) 12:26:30 - iwa 先日も投稿させて頂きました、iwaです。 サブクローニングに初めて取り組んでいるのですが（学部の研究室配属での実習です）、うまくいきません。 12.9kbのベクターに1.3kbのインサートを挿入するのですが、制限酵素はXbaIしか用いることができません。 ・ベクター側（12.9kb） 「XbaI(37C, 60min)→CIAP（37C, 60min）→1%アガロースゲルで泳動（50V, 60min）→ゲル切り出しと抽出」という手順で用意しています。 CIAP処理は、50uLの反応系にそのままCIAPとBufferを加えています。 ゲル切り出しの際には、UVを一切当てていません。 ・インサート側（1.3kb） 「TAクローニングで作製されたベクターをXbaI処理（37C, 60min）→1%アガロースゲルで泳動（50V, 60min）→ゲル切り出しと抽出」という手順で用意しています。 こちらも、ゲル切り出しの際には、UVを一切当てていません。 ・ライゲーション 16Cでover nightした後、ヒートショック60C, 10minを行っています。ベクター：インサート比は1:1, 1:3, 1:10を試しています。その後、コンピテントセルに形質転換しています。 現在のところ、上記のプロセス通りに実験を進めているのですが、コロニーが数個しか出てこず、いずれもハズレです。 なお、XbaI処理したベクターのみをCIAP未処理でライゲーションすると、コロニーが500〜1000個は出ているように見えます。 上記のプロセスで修正すべき点はありますでしょうか。 身近に指導して頂ける先生が今週・来週といないため、皆様からのご意見を頂ければ嬉しく思います。 3月末でバイオの世界とはお別れなのですが、ここまできて未成功というのも悔しいので…。

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