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(無題) 削除/引用 No.3843-41 - 2015/02/16 (月) 11:46:09 - ~ >どこでつまずいているかを調べるために、�@および�Aを早速行ってみたいと思います。 なぜ"�B"を削ったのでしょうか… >�@ベクター（CIAP処理あり）のみ、ライゲーション無 >�Aベクター（CIAP処理あり）のみ、ライゲーション有 >�@と�Aでも10個強のコロニーが出ていました。 これと"�B"のコロニー数の比較で、当たりがありそうかを判断するのですが、 前回の50個と、今回の�Bの40個をそのまま比較することはできないでしょう。 同時に行っていれば、10個増えているので、この中に当たりがあるかもと思いますが、 別の時に行ったため、誤差の範囲に埋もれてしまいます。 ただ、今回の結果から、 ・CIAPなしならセルフライゲーションが得られる →CIAP処理前の時点でベクターに重大な問題はない ・CIAP処理でセルフライゲーションのコロニー数が10程度に減っている →この位セルフライゲーションが出ていても、当たりのコロニーが出れば、 　そちらを拾うことができるので、重大な問題ではない ・ライゲーション無でベクター＋インサートで、コロニー数がベクターのみより 　増える 　→インサート側も若干の切れ残りはあるが、重大な問題となる数ではない と考えられます。 私なら、ベクター側の調整には問題なさそうと考えて、 ・毎回ネガコン（�@、�A）を置いた上で、濃度比を幅広く振って 　ライゲーションし、コロニー数が増えた時はミニプレップで中身を確認 →最適な比率を探すのと、ライゲーションの数をこなしてたまたま 　当たりがたくさん出る時があることを期待して。 ・CIAP処理無しのベクターでインサート有無しでライゲーションし、 　コロニー数が変わるか比較する →CIAP処理でベクターが削れていないか判断するため ・pBluescriptをXbaI処理してインサートを入れてみる →インサート側に問題がないか確認するため あたりを試すと思います。

(無題) 削除/引用 No.3843-40 - 2015/02/15 (日) 18:55:06 - おお >[Re:39] monさんは書きました : > >[Re:38] おおさんは書きました : > > APに示していただいた文献ではnuclease S1 resistantになっていて、これsingle strand DNAをきるよね。endonucleaseだし。。。 > あれ？そうは読めませんが。 あ、よめませんね。endonucleaseのことを思いながら図だけみてました。しつれいしました。

(無題) 削除/引用 No.3843-39 - 2015/02/15 (日) 18:04:08 - mon >[Re:38] おおさんは書きました : > APに示していただいた文献ではnuclease S1 resistantになっていて、これsingle strand DNAをきるよね。endonucleaseだし。。。 あれ？そうは読めませんが。

(無題) 削除/引用 No.3843-38 - 2015/02/15 (日) 16:55:36 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/pdf/nar00459-0126.pdf APに示していただいた文献ではnuclease S1 resistantになっていて、これsingle strand DNAをきるよね。endonucleaseだし。。。

(無題) 削除/引用 No.3843-37 - 2015/02/15 (日) 16:45:41 - おお >[Re:35] monさんは書きました : > >[Re:33] おおさんは書きました : > > 変性cccにはsingle strand部分があるのですか? > 変性cccって、2本鎖が解離して(全体的あるいは部分的に）再会合できていない、single strand circle DNAが絡まって？いる状態だと考えていますが、違うのかな？ そうかもしれないっていうぐらいでなんとも、、、

(無題) 削除/引用 No.3843-36 - 2015/02/15 (日) 16:43:18 - おお >[Re:34] iwaさんは書きました : > おおさん > > アドバイスありがとうございます。 > そういう作戦もあるのですね。 > その際、セルフライゲーションしたvectorを排除することは可能なのでしょうか？ 厳密にいうとサイズの違いで分けれる可能性はありますが、プラクティカルにはさいずにもよるかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.3843-35 - 2015/02/15 (日) 14:32:09 - mon >[Re:33] おおさんは書きました : > 変性cccにはsingle strand部分があるのですか? 変性cccって、2本鎖が解離して(全体的あるいは部分的に）再会合できていない、single strand circle DNAが絡まって？いる状態だと考えていますが、違うのかな？

(無題) 削除/引用 No.3843-34 - 2015/02/15 (日) 14:04:40 - iwa おおさん アドバイスありがとうございます。 そういう作戦もあるのですね。 その際、セルフライゲーションしたvectorを排除することは可能なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3843-33 - 2015/02/15 (日) 14:01:46 - おお 変性cccにはsingle strand部分があるのですか?

(無題) 削除/引用 No.3843-32 - 2015/02/15 (日) 13:58:39 - iwa monさん アドバイスありがとうございます。 ATP-dependent DNaseについて初めて知りました。 私が今お世話になっている研究室にはたぶんないと思います…。 やはり、ネガコンゼロは難しいものなのですね。 他の方からご指摘を頂いたように私もネガコン・ポジコンを置いてみたのですが、 �@ベクター（CIAP処理あり）のみ、ライゲーション無 �Aベクター（CIAP処理あり）のみ、ライゲーション有 �Bベクター（CIAP処理あり）＋インサート �Cベクター（CIAP処理なし）のみ、ライゲーション有 のうち、�@と�Aでも10個強のコロニーが出ていました。 （�Bでは40個程度、�Cでは1000個程度です。） ATP-dependent DNaseを利用するのは無理だと思うのですが、泳動時間を長くするというのは可能ですので、こちらにをtryしてみます。

(無題) 削除/引用 No.3843-31 - 2015/02/15 (日) 13:44:24 - mon >[Re:30] おおさんは書きました : > この酵素は環状のDNAには効果を発揮しないとなってますが、、、 single-strand なら環状でも切るようです。変性cccのsingle-strand 部分が切断されるのでは？ ””Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase digests linear dsDNA to deoxynucleotides at slightly alkaline pH and, with lower efficiency, closed-circular and linear ssDNA”

(無題) 削除/引用 No.3843-30 - 2015/02/15 (日) 13:05:29 - おお >大きいベクターにサブクローニングする場合は、ATP-dependent DNase (PlasmidSafeなど）で前処理しておくと、制限酵素の切れ残り（切断耐性分子=変性plasmid?)が激減し、成功率が上がりますのでお勧めです。 変性plasmidといいますか変性CCCはnuclease 耐性となってますが、ATP-dependent DNaseできれますか? この酵素は環状のDNAには効果を発揮しないとなってますが、、、

(無題) 削除/引用 No.3843-29 - 2015/02/14 (土) 23:59:21 - おお なるべく多量をligationして、open circular をゲルから切り出しっていうてもあるけど。

(無題) 削除/引用 No.3843-28 - 2015/02/14 (土) 18:29:55 - mon 大きいベクターにサブクローニングする場合は、ATP-dependent DNase (PlasmidSafeなど）で前処理しておくと、制限酵素の切れ残り（切断耐性分子=変性plasmid?)が激減し、成功率が上がりますのでお勧めです。ライブラリー作成などcriticalなクローニングには必ず用いています。 大きいベクターは、切断後ゲルから切り出しだけではインサートなしのネガコンによるコロニーを０をするのは難しい印象があります。 また、用いる制限酵素部位（特に平滑末端、また周囲の配列の影響もあるようです）によっては、ライゲーションが成功しないときが有り、別の部位を平滑化してライゲーションするとアッサリ成功することもあります。 まあ、最近はサブクローニング計画時に（様々な方法で）平滑末端のライゲーションを行わないようにしています。PCRでインサートを調製する場合は、InFusion等を使うことも考慮します(ただし多めのDNAが必要なので効率は低い印象）。InFusion法では希ですが目的末端が削れたことがあったので、制限酵素部位を付加しておくこともあります（インサートの有無の確認も容易になる）。 で、手持ちの材料での改善点は、切断したベクターのゲルから切り出し時に長時間泳動し、ゲルの真ん中より下から切り出すと、成功率が上がります。またはゲルスライスを再度新しいゲルに埋め込んで再泳動して切り出すのも効果的です。

(無題) 削除/引用 No.3843-27 - 2015/02/14 (土) 12:38:40 - iwa qwさん 恥ずかしながら、存じ上げませんでした。 手元にある制限酵素でそれが可能であれば、試してみたいと思います。 おおさん insertは1.3kbです。 バンドの光加減が小さすぎて見落としただけかもという期待を込めて、今度はオーバーロード気味になるように流してみたのですが、変わらない結果でした。 プレートは冷蔵庫にあります。

(無題) 削除/引用 No.3843-26 - 2015/02/14 (土) 00:11:28 - おお ちょっとまって、insertのサイズってどれくらいでしたっけ、、、ちいさければ、12.9kbがオーバーロード気味でないと切り出されたバンドの光具合が弱くて見落としてるかもしれない。。。insertの中で切れる酵素でベクター内に一か所あるような酵素(ぜったい一か所でないといけないわけではありませんが)できると認識しやすいけど、いままでミニプレップしたやつのこってる。それかプレートとか。

(無題) 削除/引用 No.3843-25 - 2015/02/13 (金) 17:25:09 - qw ＞得られたDNAをXbaIでcutして泳動したところ、vectorの位置 ＞にのみバンドが見られ、insertの位置には全くバンドが 大変失礼なのは重々承知のことととして、大腸菌のゲノムが残っていると12kbp辺りに出てくることは知っていますよね？ プラスミドがとれていない可能性も疑った方が良いのではないかと思います。 プラスミドを真っ二つに二箇所切断できる制限酵素で切ってみてはいかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3843-24 - 2015/02/13 (金) 17:16:12 - iwa おおさん コメントありがとうございます。 ご指摘の通り、12.9kbのベクターの空のものです。 最終的に大腸菌から抽出して得られたDNAをXbaIでcutして泳動したところ、vectorの位置にのみバンドが見られ、insertの位置には全くバンドが見えませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3843-23 - 2015/02/13 (金) 17:11:17 - iwa ~さん ご指摘ありがとうございます。 どこでつまずいているかを調べるために、�@および�Aを早速行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3843-22 - 2015/02/13 (金) 14:23:33 - おお >[Re:20] iwaさんは書きました : > さくさん > > 脱リン酸化処理に問題があった（時間が短い？）、切り出しの際に脱リン酸化されていないベクターが混入した、といったことが原因なのでしょうか？ > ゴールに近づいたと思ったのですが、まだまだのようです。 まずligationされてないプラスミドでもtransformation活性はあります。活性がintactのプラスミドにくらべて極端に低いだけです。また脱リン酸か酵素が99.9%のDNAのリン酸を外したとしてでもまだselfのligationするやつが残っているわけですよね。私は100%は絶対にないんじゃないかと思っています。そう言うのを考慮に入れると50個ぐらいのバックグランドはいいコンピを使っていたら出てもおかしくないと思ってます。 そのはずれは、13kbだっけ、、のベクターの空のものですか?

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