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(無題) 削除/引用 No.3841-11 - 2015/02/10 (火) 20:10:02 - E64 ちなみにやり直す羽目になったミスとは、DNAとP3000 regentを混合したとき、白い浮遊物が生じたため、DNAが析出したと勘違いしてSTOPしたことです。サポートに問い合わせると、DNAの溶媒にEDTAが含まれていると析出物がでることがあると。 そのままtransfectionを進めても良いし、再精製してDNAを水に溶かして仕切りなおしても良いといわれましたが、transfection regentをmixして時間がたっていたので再精製を選んでしまいました。Lipofectamine3000をお使いの場合、ご注意ください。

(無題) 削除/引用 No.3841-10 - 2015/02/10 (火) 19:57:14 - E64 皆様 コメントどうもありがとうございます。 DNAはshRNAライブラリーで、ウイルスパッケージングベクターとのmixなため 最購入すると極めて高額なため、できることならrescueしたいのですが、、、でなければ PCRでRNAi配列を増幅して自分でライブラリーを再構築するか でしょうか。 最初、Life technoogiesのサポートに問い合わせたら、フェノクロエタ沈で回収できるといわれたので、安易に進めてしまったのが敗因かもしれません。 まずは、溶けるまで水で希釈して再度アルコール沈殿を試みてみます。 中年さん＞エタチンメイトは、以前transfection用ベクターの精製に使用しましたが、vectorは入ったと記憶しています。確かに絶対量としては確かに大量に混入するので気にはなりますが、対DNA比としては微々たる量かと。。。

(無題) 削除/引用 No.3841-9 - 2015/02/10 (火) 18:41:10 - 中年 メインのご質問については皆さんがお答えになっているとおりだと思いますが、それとは別にトランスフェクションするDNAサンプルにエタチンメイトが混入することは大丈夫なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3841-8 - 2015/02/10 (火) 18:01:30 - AP lipofectamineはPCIで除けていると思うけれど、DMEMの成分が問題でしょう。 ほとんどが水溶性、しかしアルコールには溶けにくい物（アミノ酸や塩）はほぼそのまま濃縮がかかるんじゃないですか。 2-PrOH (IPA) pptは、DNA溶液に対して0.5-1 volのIPAといわれていますから、ちょっと入れすぎ。そうでなくても、EtOHに比べIPAは塩などを沈殿させやすいといいますから。むしろ2 vol EtOHのほうが希釈されてよかったかも。 おそらく、IPA沈殿で難溶性の塩を生じてしまってDNAも巻き込まれているんでしょう。液量を増やしてなんとか溶解して、十分に希釈した状態でアルコール沈殿をして、あるいは透析、限外濾過をして夾雑物を除いていくとかしないと、同じことに繰り返しになるんじゃないかな。面倒くさい。やっぱり大腸菌から精製しなおしたほうがいいんじゃないか。

(無題) 削除/引用 No.3841-7 - 2015/02/10 (火) 17:38:10 - mon なんかグダグダやっているより、 大腸菌培養してプラスミドを精製した方が早く、かつ安心出来るかも。

(無題) 削除/引用 No.3841-6 - 2015/02/10 (火) 13:09:11 - おお 1% SDS, 6M guanidine or 6M Ureaの溶液でけんだくして、それでしばらくor O/Nで室温とかで(あたためてもいいですけど)、放置or rotateしてみてください。そのあとはエタチンですが、そう言うものがうまく除けるほうほうがあるかよくわかりません。しりかメンブレんとかだとうまくいくかもしれませんけど、そのときはUREAは使わない方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.3841-5 - 2015/02/10 (火) 12:54:51 - E64 plさん コメントありがとうございます。 PCI中のクロロフォルムで脂質は はずれるかと思っていたのですが、pureなクロロフォルム（かCIA)でないとダメということでしょうか？ 一応、今は37℃でincubate中ですが、溶けないようなら温度を上げようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3841-4 - 2015/02/10 (火) 12:50:11 - pl 脂質とDNAの複合体の状態からのスタートですよね。 PCIとアルコール処理でDNAが複合体から解離するのか疑問です。 複合体のまま沈殿させたから溶解しなくなったということも考えられそうです。 気休め程度かもしれませんが、溶解するとしたら60度くらいに暖めてみるとか。

(無題) 削除/引用 No.3841-3 - 2015/02/10 (火) 12:12:15 - E64 早速のお返事ありがとうございます。 TE bufferの量を増やしてピペッティングし、 再度遠心して上清のO.Dを図ると、上清中の存在量が増加しているので おそらくDNAはペレットにあるのではないかと考えていますが...

(無題) 削除/引用 No.3841-2 - 2015/02/10 (火) 12:06:29 - 中年 懸濁状態でUV吸収があっても、それがDNAによるものとは判断できないのでは？

精製後のDNAペレットの溶解法に関して 削除/引用 No.3841-1 - 2015/02/10 (火) 11:59:52 - E64 Lipofection過程でミスが発覚したため、一度plasmidを回収する目的で PCI→イソプロ沈を行ったところ、ペレットが溶解しません。 具体的にはLipofectamine3000のP3000 regent(720 uL)とplasmid DNA(360 ug)を GlutaMax-DMEM (20 mL)で希釈した状態からplasmidを精製するために 1) 20 mLのPCI (Sigma; p.H 8.0に調整済み)と混合して上清を回収 2) 20 mLのTE bufferを下層に加えて逆抽出し、 　 フェイズロックゲル(Heavy)を用いて上清を完全に回収 3) 上清を6 mL×6に分割し、それぞれ3 uLのエタチンメイト、 　　600 uLの3M CH3COONaを加えて混合 4) 7 mLの2-プロパノールを加えて混合し、-20℃でO/N 5) 5,000 gで30 min遠心後にペレットを75% EtOH 7 mLで同様にリンス 6) ペレットがゆるいので、それぞれ約1 mLの残った上清と共に 2 mL tubeに移して15,000 gで20 min遠心。 7) ペレットの周囲が透明になったら100 uLの10 mM Tris-HCl buffer (p.H 8.0) 　　を加えて4℃ O/N この手順でペレットが溶解せず、ピペッティングしても懸濁物が残ります。Mg塩の存在を考えて、EDTAをfinal 1 mMで添加しましたが解けません。 O.Dを計測すると、ペレットを遠心で沈殿させると上清にDNAがほとんど無く、 一方 懸濁状態で測定するとDNAが検出されるので、DNAがペレットとして存在していることが示唆されます。TE bufferで希釈しながらO.Dを測定していくと、少しずつ溶けるようですが、最終的なvolumeが許容範囲外になりそうです。 この状態からDNAをrescueする方法に関して、何か方法があれば教えていただけないでしょうか？貴重なサンプルであるため、よろしくお願いいたします。

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