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(無題) 削除/引用 No.3832-11 - 2015/02/19 (木) 12:30:13 - AP >断片化に関しては1000b以下ならあまり問題ないという意見もあり実施していなかったのですが、 まあIVTは、特に標識ヌクレオチドを基質とした場合、伸長性があまり高くないので、たまたま完全長まで伸びきっていないプローブが多かったりすると、問題なくワークしたように見えることはあるかもしれません。 原理的・理論的には長鎖のプローブは不適当であり（過去トピでもさんざん論議されています）、あえてそれに逆らうのは賢明ではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3832-10 - 2015/02/19 (木) 09:58:25 - AP >プローブによって認識部位が大きく変わるものなのでしょうか？ これについての私の想像は http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3316 のNo.3316-8

(無題) 削除/引用 No.3832-9 - 2015/02/19 (木) 01:11:09 - シジュルカ AP様 ご指摘ありがとうございます。スポットテストを実施したところDIG labelingに問題は見当たりませんでした。断片化に関しては1000b以下ならあまり問題ないという意見もあり実施していなかったのですが、年度末ということもありすぐに対応できない状況です。 -~様 ご指摘の通り実験系自体をゼロから立ち上げたわけではございません。今回は特異的染色像が得られないという結果を踏まえ、自作プローブとISH(発色反応)の２つに分けて検証しました。 後者に関してはラボでワークしているものを使用したところ、自身でサンプリングした切片でも特異的シグナルを確認することができました。一方で自作プローブでISHを実施したところ、特異的シグナルは認められずセンス・アンチセンス両方でバックが出てくるのみという結果でした。プローブ合成時にDIGラベリングが失敗した可能性を検証するため、今回スポットテストを行いましたが問題なく検出できました。 今回は1000bのプローブ作製で進行していましたが、最終的なシークエンスチェックではFoward側とReverse側はしっかり入っていましたが、真ん中の100bぐらいがごっそり抜けている状態でした。それでもBlast検索では残りの配列の部分が100%マッチしていました。 はじめての実験でトラブルシューティングが十分でないかと思いますが、他にも気になる点等があればご指摘いただけないでしょうか。 現在はラボでワークしている(自分でもワークした)プローブを一から同じ配列で作り直し、ISH発色までを通して確かめようかと考えています。また他の人は同じ遺伝子でも2-3種類のプローブを作製して混ぜて使用したりという話も聞きました。私は１種類しか作製しなかったのですが、ほとんどワークしないということもよくある話なのでしょうか？またプローブ作製時のプライマー配列での注意点等もあればお教えいただけないでしょうか。 長文となってしまいましたがどうぞよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3832-8 - 2015/02/10 (火) 10:27:44 - ~ >当ラボでISHの実験系を立ち上げようとしている と書かれていましたので、0から実験系を組もうとしていると思っていたのですが、 >現在はラボでワークしていて、なおかつ発現部位も明らかなプローブを用いて、自分の手技でISHを実施しているところです といことは、ラボの他のメンバーはISHがうまくできていて、 同じ材料・キットを使いご自身でやってみたらうまくいかないということでしょうか？ そうであれば、そのできる人にお願いして、一緒にやってもらってはいかがでしょうか。 または、使っている切片やプローブの余った分を分けてもらって、 それを使ってISHしてみるとか。

(無題) 削除/引用 No.3832-7 - 2015/02/09 (月) 21:17:47 - AP 少なくともスポットテストと断片化は基本でしょう。ロシュのを含め手引き書には必ずのべられていることでは。断片化はものによって、500 nt以下とか、平均300 ntとか、100 nt前後とか、いろいろ言われていますが、1 kbはないと思うなあ。 ルーチンに出来るようになったらアレンジや手抜きもいいけれど、初めは手本どおり教科書どおりに忠実にやるべきでは。ロシュの手引き書でもしっかり読んでやってみましょうよ。よそで相談するのは、それでもどうしても上手くいかないときです。

(無題) 削除/引用 No.3832-6 - 2015/02/09 (月) 20:41:35 - シジュルカ 通りすがりA様 ご指摘ありがとうございます。 現在はラボでワークしていて、なおかつ発現部位も明らかなプローブを用いて、自分の手技でISHを実施しているところです。これでサンプル(標本)作製またはハイブリダイゼーションの手技に問題があれば原因が分かりそうなのですが。。 AP様 染色条件が多少なりとも悪くてもシグナルが得られるのであれば、プローブ側も疑わないといけないのかもしれません。 ご指摘にありましたプローブの断片化、スポットテスト、ノーザンは実施しておりません。断片化に関しては1kbという長さでも重要な操作になるのでしょうか？またプローブの信頼性という意味でスポットテストやノーザンは毎回やらないといけないほどプローブの信頼性は低いものなのでしょうか？ プローブの信頼性に関しては注意しないといけないと思っております。同じ標的の異なる配列でも試してみるという注意は他でも目にしましたが、プローブによって認識部位が大きく変わるものなのでしょうか？まだISHの経験が浅いため、これらのイメージがつきにくい状況です。。

(無題) 削除/引用 No.3832-5 - 2015/02/09 (月) 18:19:28 - AP やはりプローブがいちばん疑わしいと思うんですが、 ・1 kb RNAプローブは断片化処理しているんですよね？（ちなみに一本鎖RNAだからkbPは不適当） ・プローブのチェック（スポットテスト）の結果は良好でしたか？ ・同じプローブでブロッティング（ノーザン）をやったらちゃんと標的が検出できるでしょうか。 ・同じ標的RNAでも、プローブに選ぶ配列によって上手くいったり行かなかったりすることがあります。今選んでいる配列自体が、あまりいい所じゃないのかも。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=854 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3316 過去にも論議されていましたが、プローブの不良、プローブに選択した配列の不良でどうしてもうまくいかないということもあるので、今あるプローブに固執しないで、ほかの配列のプローブも作って同時に試してみるくらいがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3832-4 - 2015/02/09 (月) 18:17:58 - 通りすがりA ポジコンとして使用できるプローブはありますか？ なければ分譲してもらって、話はそれからな感じもします。

(無題) 削除/引用 No.3832-3 - 2015/02/09 (月) 17:47:25 - シジュルカ AP様 ご回答ありがとうございます。 手本はラボで経験者の方がいることからその方に教えてもらいながら実施しています。またRocheのトラブルシューティングも拝見させて頂いております。 RNaseのコンタミでシグナルが完全に消えることはないのですね。。。今回の場合はシグナルが全く出ていないので、他の原因かもしれません。 今回はRNA probe(1kbp)で作製を行ったので何とか検出できる系を立ち上げたいと考えております。今後はDNA probeでも同様の結果が得られるのでしたら、利便性も兼ねて検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3832-2 - 2015/02/09 (月) 16:51:13 - AP なにを手本にしていますか？ RocheがDIG in situのハンドブックを出していて（無料冊子版、DL版）、実験例やトラブルシューティングが豊富に載っていますから、それを参考にして手技を検討したらよかろうと思います。 私見では、 ・RNaseのコンタミに厳重に注意せよといわれるけれど、過大に神経質になりすぎ。ISHのネガコンとして標本をRNase処理しても、完全にシグナルを消すのは至難。まして、普通に操作してシグナルが全くなくなるようなRNaseのコンタミは考えにくい。 ・RNAプローブはセンス鎖のプローブでネガコンをとるのに都合よかったり、DNAプローブより感度が良いといわれているので、それ以外の方法が全く念頭にない人もいますが、多くの場合DNAプローブでもワークします。DNAプライマーのほうが収量やラベル効率が安定していて失敗が少ないと思います。ランダムプライマーラベル、あるいは　PCRベースのラベルをします。PCRの場合は、プローブが長すぎると浸透性が悪くなって使えないので、短いアンプリコンにするか、ラベル後に断片化します。プライマーを片側だけにすればRNAプローブのようにstrand-specific probeも作れます。

In situ hybridization 削除/引用 No.3832-1 - 2015/02/08 (日) 20:53:26 - シジュルカ 当ラボでISHの実験系を立ち上げようとしているのですが、発色後のシグナルが得られずご質問させていただきたいです。 これまでにSP6もしくはT7 RNA polymeraseで作製したRNAプローブ(練習なので発現部位既知のもの)を用いて成体脳でのISHを実施しました。結果としてはSense、Anti-senseの両方で何もシグナルが得られませんでした。 ご質問させて頂きたいのはこのような場合のトラブルシューティングをどの段階で行えばいいのかです。 RNAプローブ作製ではシークエンスによるインサートの確認を行い、制限酵素処理後(泳動パターン確認)にRNA polymeraseで反応させました。その後の泳動ではバンドが2〜3本見られました(目的サイズが最も低く、そのすぐ上とさらに高い位置にそれぞれバンド有)。 ISHではマウス成体脳を頸椎脱臼後早急に摘出(還流固定なし)して、OCTコンパウンド包埋後に20μm切片厚で凍結切片を作製しました。その後すぐに4%PFAで30分間固定をし、PBSで洗浄・風乾後に-70℃保存しています。 RNAプローブ作製とISH発色のそれぞれでDIG RNA labeling反応や組織切片側のRNaseコンタミ等を疑っています。それ以外でも構いませんし、何かアドバイスがあればご指摘いただけないでしょうか。 ちなみに今回のISHはホルムアミドを用いたハイブリを2O/N→DIG-AP O/N→BCIP/NBT反応 O/Nで検出を行いました。

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