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(無題) 削除/引用 No.3828-12 - 2015/02/11 (水) 13:44:48 - おお >ただウェスタンには適用できないものが多いようです。 ウエスタンでみた図におぼえがあるんだよな。。。ごめんなさいまだ調べきれてません。。。ひとつはneurodegenerative disease関係のろんぶんでした。

(無題) 削除/引用 No.3828-11 - 2015/02/11 (水) 11:32:56 - rrro >[Re:10] wせdrftgyふさんは書きました : >ROSによる酸化傷害のマーカーといっても、主にどのようなタイプのROSが生じているのか（と予想されるか）によりどのマーカーが適切かということが変わってきますので、選び方を間違えると残念なことになります。 とても参考になります。慎重に検討したいと思います。 ただ、主にどのようなタイプのROSが生じるかの予想は、その細胞の種類(食細胞だ、とか)やその細胞がどのタイプのROSを産生するのか、というのを考慮するのでしょうか？ ミトコンドリアはROSを産生しますが、これは殆どの細胞にあるので、ミトコンドリア由来のROS（スーパーオキシドが主だとは思いますが、そこからH2O2や別のROSに置き換わっていったりすると思うので）も考慮すると、とても一つには絞りきれない気がします。やはり、いくつかのマーカーを組み合わせて細胞障害を見るのでしょうか？ > 実験の内容からみると、DNAの酸化傷害の分析が適しているようにもおもいます。 なぜでしょうか？確かに、使用している薬剤はDNA損傷を機序として殺細胞効果を発揮しますが、その薬剤によって生じたROSは、DNA損傷を起こすか細胞膜の蛋白に障害を起こすか、（至る所に影響するとは思いますが）分かりません。 素人でお恥ずかしいです。

(無題) 削除/引用 No.3828-10 - 2015/02/09 (月) 15:54:37 - wせdrftgyふ nitrotyrosine, dityrosine, bromotyrosine, クロロチロシンなど酸化修飾アミノ酸残基特異抗体が市販されています。ヒスチジンが酸化されたオキソヒスチジンも昔から知られていてHPLCで定量されたりしていましたが、特異抗体は作られていない（うまく作れない）ようです。上記抗体は主に組織／細胞染色でしばしば使用されています。ただウェスタンには適用できないものが多いようです。重要なことは産生される活性酸素種により修飾の種類が異なる事です。たとえばニトロチロシンはNOとスーパーオキサイドが反応してできるパーオキシナイトライト(ONOO−)で攻撃されたときに生じます。クロロチロシンは好中球のMPOが産生するハイポクロライドにより攻撃されたときに生じます。dityrosineはOHラジカルの攻撃に付随して生じると思いますので割りと酸化ストレスマーカーとしての一般性は高い気がします。ROSによる酸化傷害のマーカーといっても、主にどのようなタイプのROSが生じているのか（と予想されるか）によりどのマーカーが適切かということが変わってきますので、選び方を間違えると残念なことになります。実験の内容からみると、DNAの酸化傷害の分析が適しているようにもおもいます。8-OHdGはOHラジカルによるグアニンの傷害で生じますので、一般的な酸化ストレスのマーカーとして使えるように思います。昔は手間のかかるHPLC／電気検出器が主流でしたが、最近は抗体が市販されていて免疫染色やELISAでも容易に定量できるようで、論文でもしばしば見かけます。ただ気をつけないとアーティファクトを拾いやすいことと、POD/BAB系検出の免疫染色でよく行われるH2O2処理がネックかもしれないのです。なので、検出はALP系の方がいいかもしれません。なお8-OHdG以外にも酸化修飾塩基は知られています。抗体があるかどうかは分かりません。

(無題) 削除/引用 No.3828-9 - 2015/02/09 (月) 14:45:12 - おお >[Re:8] rrroさんは書きました : > > http://www.a-biodesign.com/oxidative_stress_product.pdf > > > > Anti-DiTyrosine かな。。。私が昔見たのはこれではなかったような気が、、、 > > 3-NT(ニトロチロシン)も酸化ストレスのマーカーとして使用されるようですが、これではないのでしょうか？ > > ニトロはついてないやつだったような気がしてるんですが、、、はっきり覚えてないので、、、時間があるときにどれだったか調べておきます、、、まあおしめしの抗体もマーカーとして使えるといううたい文句ではありますので、そのことに関しては異論はないです。

(無題) 削除/引用 No.3828-8 - 2015/02/09 (月) 14:33:19 - rrro >[Re:7] おおさんは書きました : > べんきょうになります。これとは別に直接酸化したアミノ酸を認識する抗体があったと記憶しています。 > > http://www.a-biodesign.com/oxidative_stress_product.pdf > > Anti-DiTyrosine かな。。。私が昔見たのはこれではなかったような気が、、、 3-NT(ニトロチロシン)も酸化ストレスのマーカーとして使用されるようですが、これではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3828-7 - 2015/02/09 (月) 06:49:04 - おお >[Re:6] 木下さんは書きました : > > カルボニル化された蛋白質を2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH)でラベルしanti-DNPで検出す方法がよく使われます。 > http://www.cosmobio.co.jp/export_e/products/detail/products_sml_20080117.asp?entry_id=4100 べんきょうになります。これとは別に直接酸化したアミノ酸を認識する抗体があったと記憶しています。 http://www.a-biodesign.com/oxidative_stress_product.pdf Anti-DiTyrosine かな。。。私が昔見たのはこれではなかったような気が、、、

(無題) 削除/引用 No.3828-6 - 2015/02/09 (月) 06:21:40 - 木下 >[Re:5] おおさんは書きました : > >そういった意味でも8-OHdG以外にも、薬剤Aにより誘導されたROSによる細胞障害が起きているかを裏付ける実験が必要だと考えています。 > > 蛋白も酸化した蛋白特異的な抗体があります。tyrosineがROSなどのアタックで酸化した産物に反応するんだったと思います。あれhistidineだったかな、、、 カルボニル化された蛋白質を2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH)でラベルしanti-DNPで検出す方法がよく使われます。 http://www.cosmobio.co.jp/export_e/products/detail/products_sml_20080117.asp?entry_id=4100

(無題) 削除/引用 No.3828-5 - 2015/02/08 (日) 14:10:46 - おお >そういった意味でも8-OHdG以外にも、薬剤Aにより誘導されたROSによる細胞障害が起きているかを裏付ける実験が必要だと考えています。 蛋白も酸化した蛋白特異的な抗体があります。tyrosineがROSなどのアタックで酸化した産物に反応するんだったと思います。あれhistidineだったかな、、、

(無題) 削除/引用 No.3828-4 - 2015/02/08 (日) 13:55:28 - おお ttp://www.cellbiolabs.com/8-ohdg-dna-damage-elisa ttp://www.epigentek.com/catalog/epiquik-ohdg-dna-damage-quantification-direct-kit-fluorometric-p-2933.html?currency=USD&height=190&width=500&border=1&modal=true&random=1423371006724 ttp://www.jaica.com/e/8ohdg_tissue.html ttp://www.enzolifesciences.com/ADI-EKS-350/dna-damage-elisa-kit/

(無題) 削除/引用 No.3828-3 - 2015/02/08 (日) 12:35:42 - おお ラジカルスカベンジャーとか抗酸化剤でレスキューできればROSの関与はいえるんじゃないかとおもうのですが。 また8-OHdGとかELISAとかそう言うたぐいのキットも販売されているとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3828-2 - 2015/02/08 (日) 12:01:39 - rrro 補足ですが 核酸障害以外にも、細胞膜上のリン脂質、蛋白、糖質を障害することも考えられると思います。 そういった意味でも8-OHdG以外にも、薬剤Aにより誘導されたROSによる細胞障害が起きているかを裏付ける実験が必要だと考えています。 （単にROSが誘導された、というだけではそのROSが細胞障害を起こしている原因だと結論づけられないと思うので） 論文を参考に実験を考えていますが、皆様のご意見も頂けると助かります。 よろしくお願いします。

ROSによる核酸障害の指標 削除/引用 No.3828-1 - 2015/02/08 (日) 11:51:03 - rrro 薬剤Aによる細胞障害について解析しています。 ある遺伝子をノックアウトした細胞と、野生型の細胞で実験を行っています。 薬剤AによるROSの生成が細胞障害を誘発し、抗がん剤効果を発揮していると仮定し、両細胞に薬剤Aを添加しました。 （薬剤Aは代謝拮抗薬で、DNAポリメラーゼと競合阻害することによりDNA合成を阻害します） 結果、ノックダウン細胞では野生型と比較し、ROSの生成が低下していました。(ROS測定には蛍光プローブを用いたフローサイトメトリーにより検出しています) この結果を発表したところ、核酸障害の指標である8-OHdGの測定は行ったのかとご意見を頂きました。 正直、8-OHdGを測定するためのHPLCも研究室にはありませんし、必要性が高くないのであれば測定しない方向でいきたいと思っています。 この分野に関しては素人なので、経験者のご意見を伺いたいです。 よろしくお願い致します。

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