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(無題) 削除/引用 No.382-8 - 2012/04/10 (火) 13:46:38 - TS >shRNAオリゴを組み込んだ後、Neomycin薬剤の入ったプレートに播種。一つのコロニーをピックアップして、Neomycin薬剤の入った液体培地で培養、大量精製後、シークエンスに提出しているため、セレクションがかかっている細胞にはshRNA配列が入っていると考えられます。 これは一体なんのことですか。 細胞からDNAかRNAを抽出して、シークエンスをかけている?? それとも大腸菌の話?　でも大腸菌ならカナマイシンかアンピシリンだよね。 なんかいろいろごっちゃになっているような。。。

(無題) 削除/引用 No.382-7 - 2012/04/10 (火) 12:25:52 - 〜 stableをとりたい場合、ただの発現プラスミドだと使い勝手が悪いです。 レンチかレトロを使うべきでは？ お金に余裕があれば、出来合いのものを買えばいいし（mission shRNAなど）。

(無題) 削除/引用 No.382-6 - 2012/04/10 (火) 09:09:44 - ~ >実際一番最初にTransientでKD効率を確認したところ、KD効率が見られず これが一番重要なデータだと思いますが。 ベクターの導入効率は見ていますか？ 10%程度しか入っていないのでKDが確認できないのと、90%以上入っているのに見えないのとでは、そのshRNA配列で検討を続けるかの判断が変わってくるかと思います。 >一つのコロニーをピックアップして クローンで実験するのであれば、クローナルバリエーションの影響を見るために複数クローンを見たほうがいいのでは。 >シークエンスに提出しているため、セレクションがかかっている細胞にはshRNA配列が入っている 心配しているのはサイレンシングです。 ゲノム上に当該DNA配列があることと、発現していることは切り分けなければいけないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.382-5 - 2012/04/09 (月) 21:20:18 - モモ >１つは３つともを同時に導入した細胞を作製することとしました これをするなら、普通は３種類の薬剤でセレクションしますよね。

(無題) 削除/引用 No.382-4 - 2012/04/09 (月) 14:13:14 - １５ TS、~様 　早急な御返答ありがとうございます。 　shRNAオリゴを組み込んだ後、Neomycin薬剤の入ったプレートに播種。一つのコロニーをピックアップして、Neomycin薬剤の入った液体培地で培養、大量精製後、シークエンスに提出しているため、セレクションがかかっている細胞にはshRNA配列が入っていると考えられます。 　長期間かけてセレクション・クローニングするのを避けたいのですが、Transientで行いKD効率が微妙な場合に、セレクションがかかっていないからではないか、と懸念する必要があります。 　実際一番最初にTransientでKD効率を確認したところ、KD効率が見られず、ベクターの取説を見たら、薬剤セレクションを最低４日間する必要があると書いてあり、Stable細胞を作製したいことや、微妙な結果になることを避け、それならばと、Stableとしました。 　自分では確認しておりませんが、ターゲット遺伝子は細胞増殖速度には影響を与える報告はないかと思います。 　trangientで行ってみる必要を検討致します。

(無題) 削除/引用 No.382-3 - 2012/04/09 (月) 08:57:43 - TS Transientで見られましたか？ 導入効率の悪い細胞だと、Transientで確認するのも難しいかもしれませんが、 長期間かけてセレクション・クローニングするのをやり直すのをできるだけ避けたいので、できればSilencing効果をTransientで見ておくほうがリスクが低いです。 それに、StableでSilencingをすると、代償的に回復気味になることがあるような気がします。これは経験的であり、科学的根拠がないですけど。 あと、セレクションがかかっている細胞だからshRNA配列が入っているということにはなりませんね。耐性遺伝子だけが入ってしまう細胞は少なくないと思います。 そのためにもクローニングするんだと思うですが、クローニングはしているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.382-2 - 2012/04/09 (月) 08:50:14 - ~ そのshRNAのターゲットは細胞増殖速度には影響を与えないことが分かっている遺伝子でしょうか？ 1ヶ月も増殖させている以上、増えてきているのは細胞増殖が可能でそれなりの速度で増えることが出来るものだけでしょう。 そのため、shRNAが効いて増殖しなくなった、または増殖が遅くなった細胞については得られません。 まずは、トランジェントで効果を見てみてはいかがでしょうか？ トランジェントであれば、一時的にRNA発現量が落ちた細胞のRNAも得ることが出来るでしょう。

shRNA　ノックダウン効果 削除/引用 No.382-1 - 2012/04/09 (月) 08:21:22 - １５ 　ヘアピンを持ったshRNAの発現を誘導できるベクターを購入（TAKARA pBAsiベクターNeomycin）し、shRNAオリゴを３つ合成（設計・合成は業者さんに依頼、アルゴリズム上での設計）。その際、コントロールshRNA（スクランブル）オリゴも１つ合成しました。 　設計・合成されたコントロールを含む４つのshRNAオリゴをそれぞれベクターに組み込んだ後、シークエンスに出して、変異もないことを確認しました。 　その後、４つのshRNAオリゴをNeomycin感受性のある細胞にそれぞれ導入しました。その際、１つは３つともを同時に導入した細胞を作製することとしました。合計コントロールも含めて５つの細胞になります。 　Neomycinセレクションで1カ月。セレクションのかかった細胞のみになりました。 　しかし、shRNAによる発現抑制効果をqPCRで確認したところ、４つとも抑制効果が見られません。 　考えられる問題点、自分自身気になっている点は、コントールベクターの入った細胞とshRNA の入った細胞間の細胞数の問題です。 　セルカウントして、同じ数の細胞でアッセイしていますが、カウントに誤差はあると思うためです。しかしqPCR時、GAPDHで補正しています。 　また、プライマーはshRNAの切断領域を含むように設計しております。 　今後は、まず細胞内にshRNAの配列があるかどうかをprimerを設計してPCRで調べる、セレクションかかっているので、ない、はずないと考えられますが。。。 　発現があれば、shRNAオリゴの再設計でしょうか？ 　何卒、御教授を宜しくお願い致します。。。

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