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(無題) 削除/引用 No.3819-30 - 2015/02/08 (日) 01:07:01 - ブルー >[Re:29] APさんは書きました : > >なにかの拍子でT同士がくっついて…というわけでは無いようです。逆から読んでAでしたから。 > > ligation後の分子はそうだったかもしれないじゃないですか。 > 大腸菌内でミスマッチ修復が起きたとか、そうでなくても一旦複製が起こればT-A対、あるいはA-T対なります。 確かにそうですね。シークエンスを読んだ数年前はその可能性を一番に考えていたのに、なぜか忘れ去った上、今はその可能性を思いつくことが出来なくなったとは恥ずかしい。歳かな…。

(無題) 削除/引用 No.3819-29 - 2015/02/07 (土) 16:10:49 - AP >なにかの拍子でT同士がくっついて…というわけでは無いようです。逆から読んでAでしたから。 ligation後の分子はそうだったかもしれないじゃないですか。 大腸菌内でミスマッチ修復が起きたとか、そうでなくても一旦複製が起こればT-A対、あるいはA-T対なります。

(無題) 削除/引用 No.3819-28 - 2015/02/06 (金) 14:56:01 - papa >Tがついてないものがどのていどあるのかなぁっていってる矢先に、Tが外れた>と断言されてしまったせつなさ。 ブルーさんがおしゃられるように 購入当初はほとんど青がでませんが，凍結融解を繰り返すうちに青が増えていきます． pGEMはEcoRVサイトにTがつけられているのですが，増えてきた青から調製したプラスミドはほぼEcoRVで切断を受けました．

(無題) 削除/引用 No.3819-27 - 2015/02/06 (金) 14:32:55 - ブルー pGEM-T Easyでの青コロニーの数ですが、購入直後は5〜10%以下といったところでしょうか。これを-20Cで保存していて、凍結融解を繰り返した結果（購入後1年とか経った後）20%程度にはなりました。 一度青コロニーを拾ってシークエンスしたことがありますが、両末端のTが共に外れての平滑末端同士がライゲーションした形ではなくて、Tが一個残った形になっていました。なにかの拍子でT同士がくっついて…というわけでは無いようです。逆から読んでAでしたから。なにが起こってこうなったかは（色々と推測は出来るけど）わかりません。

(無題) 削除/引用 No.3819-26 - 2015/02/06 (金) 12:12:24 - おお Tがついてないものがどのていどあるのかなぁっていってる矢先に、Tが外れたと断言されてしまったせつなさ。

(無題) 削除/引用 No.3819-25 - 2015/02/06 (金) 10:56:08 - AP Tがはずれたんだか、Tの付加が不完全なのかわからないと思いますけれどね。メーカーはT付加の効率をどの程度保証しているんでしょう？ Tが外れるとしたら、3'エクソヌクレアーゼ活性のコンタミか（校正活性のあるポリメラーゼ、PCRからの持ち込みはありうるかも）、自発的な加水分解か？

(無題) 削除/引用 No.3819-24 - 2015/02/06 (金) 09:09:17 - papa pGEM　T-ベクターははかなり青がでます，ベクター末端のTがはずれセルフライゲーションします． なので，自殺遺伝子を組み込んだTOPOベクターも用いているのですが，高いです． 最近はベクターコンストラクトはIn fusionに乗り換え中です． プライマー設計がめんどくさいですが，ものすごく簡単です． これも高いですがね．

(無題) 削除/引用 No.3819-23 - 2015/02/06 (金) 07:58:57 - T もうかなり昔の学生時代に市販のT vectorを使っていましたが、青いコロニーはほぼ必ずありましたね。 多くても両手で数えられるくらいだったと記憶してますけど、あくまで保険程度の印象でした。 インサートが入っていなくても予期しない状態で修復されて白いコロニーがでることもありますし、少数とはいえセルフの青いコロニーを避けていれば、あたりを拾う確率はわずかでもあがる程度の認識でしたね。

(無題) 削除/引用 No.3819-22 - 2015/02/06 (金) 01:26:46 - おお そういえばinvitrogenが自殺遺伝子を入れてインサートが入ってないと死ぬというシステムでTAベクターを作っているのをみたけど、TAのカラーセレクションのT付加の不完全によるself ligationの可能性を改善したものなんでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.3819-21 - 2015/02/05 (木) 23:43:27 - 中年 理想的にはセルフライゲーションは起こらない、ということに加えて、ブルーになるためには、ベクターの両方の末端のＴがちょうどその突出した１塩基だけ（もしくは+3n塩基ずつ）削れてbluntでライゲーションされるということなので、ヌクレアーゼのコンタミなどで削れてしまうならそれもホワイトなんじゃないかというつもりでした。No.3819-17でおおさんが仰っているように、ブルーってそんなに出るものなんですか？

(無題) 削除/引用 No.3819-20 - 2015/02/05 (木) 19:08:06 - こうじ 昔は似た方法で行っていました。 そのままpETに入れることが 結構大変だった時期がありました（と思っています）。 pETはNdeIを使うためにPCR産物のはじに付けたNdeIサイトが うまく切れないケースが多く そのままでは入りにくいということでLICが出たんでしたっけ？ おまけにTaqとかでクローニングしていたので結構変異が入ってましたし。 TAクローニングできるようなpETベクターが売っていないとか pETベクターはシークエンスでT7だけでdye terminator kitに入っている M13プライマーが使えないとか 一つずつ進んだほうが急がば回れで早かったと思います。 私自身は最近、high fidelityのPCR酵素を使って、 発現ベクターに直接In-fusionで入れてしまっていることがほとんどですね。 In-fusionなどでうまく行かない場合にTAクローニングしています。 PCR反応後にエタ沈してからrTaqとdATP入れてAを付けて行っています。 失敗しそうなところとしては がっつりUVを当ててアガロースゲルから目的バンドを切ってはダメですよ ここのフォーラムの過去ログを探すといっぱい出てくると思います。 後は全部青コロでもあきらめないで確認すること。 当たっていることもあります。

(無題) 削除/引用 No.3819-19 - 2015/02/05 (木) 18:00:53 - おお そうですねぇ。。。品質的な問題もあるかもしれませんね。Tの付加効率を考慮したらある程度の頻度は避けられないってことかもしれないとちょっと思ったりもしたけど、、、制限酵素を利用してTAベクター作るっていうのがあったような。。。

(無題) 削除/引用 No.3819-18 - 2015/02/05 (木) 17:52:59 - AP 論点は、ちゃんとしたT-vectorであるならば、セルフライゲーションは起こりえないので、原理的には青白選択をする必要はないはずってことですよね。青白選択なんかしないで数コロニーもチェックしたらはずすことはなかろうと。 けれど実際には、完璧じゃなくてある程度はセルフが出来てある頻度で青コロニーが生えてくる。それがどの程度の頻度で生じるのか（たとえばインサートなしでライゲーションしたときに）。T-vectorの品質（ブランド）によりそうですが、実際どんなもんでしょう。 逆に言うと青白選択が必要なほど、青が生えてくるんじゃ、T-vectorの品質が悪いということじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.3819-17 - 2015/02/05 (木) 16:08:47 - おお >[Re:16] ブルーさんは書きました : > >[Re:14] おおさんは書きました : > > >[Re:13] 中年さんは書きました : > pGEM-T Easyベクターを使っていますが、ブルーホワイトセレクションかなり良く効いてますよ。ホワイトコロニーで外れだった経験は無いです。 ちなみに青いのはどれぐらいの割合で生えてきますか?

ブルーホワイトセレクション 削除/引用 No.3819-16 - 2015/02/05 (木) 14:58:40 - ブルー >[Re:14] おおさんは書きました : > >[Re:13] 中年さんは書きました : > > TA-cloningの原理からして、ブルーホワイトセレクションはあまり有効ではないと思います。 > > あ、たしかにそうだな。。。でもカラーセレクションとかできるTA vector が作られているという不思議。 pGEM-T Easyベクターを使っていますが、ブルーホワイトセレクションかなり良く効いてますよ。ホワイトコロニーで外れだった経験は無いです。インサートが短いもの(70bp位）だった時に薄い青色をしたコロニーも拾ったりもしたことがありますが、やっぱり入ってないか−、ということばかりでした。

(無題) 削除/引用 No.3819-15 - 2015/02/05 (木) 14:49:46 - papa >追記ですが 発現ベクターの構築の際にはトランスフォーメーションという 書き方はせずにDH5αを用いて構築を行う、とするべきでしょうか？ 初心者はよくよくよく間違うのうですが， ベクターを大腸菌にトランスフォーメーションするではなく 大腸菌を（が）ベクターによりトランスフォーメーションする（される） トランスフォーメーションされるのは大腸菌です． 構築とトランスフォーメーション（形質転換）は意味が違います． 構築されてなくても（目的断片がベクターに挿入されなくても） amp耐性などにより大腸菌はトランスフォーメーションされます．

(無題) 削除/引用 No.3819-14 - 2015/02/05 (木) 14:45:24 - おお >[Re:13] 中年さんは書きました : > TA-cloningの原理からして、ブルーホワイトセレクションはあまり有効ではないと思います。 あ、たしかにそうだな。。。でもカラーセレクションとかできるTA vector が作られているという不思議。

(無題) 削除/引用 No.3819-13 - 2015/02/05 (木) 14:28:59 - 中年 TA-cloningの原理からして、ブルーホワイトセレクションはあまり有効ではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3819-12 - 2015/02/05 (木) 14:00:16 - おお >[Re:11] mnagさんは書きました : > > もし、皆様が失敗した時に > どのような対処をとるのかご参考にしたいので > そのようなものもあればアドバイスお願いいたします。 それは書いたら切りがないので過去ログをチェックしてみてください。コントロールとコンピテントの効率などがヒント。

(無題) 削除/引用 No.3819-11 - 2015/02/05 (木) 12:19:07 - mnag もし、皆様が失敗した時に どのような対処をとるのかご参考にしたいので そのようなものもあればアドバイスお願いいたします。

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