Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

ライゲーションについてです。 トピック削除
No.3805-TOPIC - 2015/02/02 (月) 12:24:23 - ken
酵素発現ベクターの構築のため、
目的遺伝子をPCRにて増幅させた後に
制限酵素　BamHTとNdeTで処理し
pET15bとpET32bを用いてライゲーションを行いました。
コンピはDH5αを用いています。
しかしながらプラスミド抽出を行い
電気泳動にて確認を行った際に
pET15bのみでしかバンドの確認はされませんでした。
どういった理由があるのでしょうか。


追記
コントロールとして流した空のベクターのバンドは現れましたが
pET32bを用いたサンプルのところには
1つのバンドも見られませんでした。

ご教示の程よろしくお願いします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.3805-10 - 2015/02/02 (月) 17:17:33 - AP
>pET32bを用いたサンプルのところには
>1つのバンドも見られませんでした。

これはつまりベクタープラスミドのバンドも見えなかったということですよね。
薬剤耐性で選択され、培養されたクローンからプラスミドが取れなかったという理解でいいですか？

(無題) 削除/引用
No.3805-9 - 2015/02/02 (月) 15:42:22 - おお
DNAが検出されないなら、検出限界以下か、ないかだわ。まあ全部完全に検出限界以下というのもどうかと思うし、もしかしたらうっすら見えてるけど写真に撮れないほどの量ってこともあるので、その辺は本人の観察力次第。まあ念のため酵素で切る量を増やして流してみてもいいかもね。

あとはligationとかがうまくいってないとかあるかもしれないけど(NdeIとか条件次第ではほかの酵素より切れにくい酵素だし)、大腸菌が嫌うような配列を含むプラスみドになってしまったかもしれない。もしそうだと大腸菌にあまりストレスをかけないようにしたり、ヒートショックを37度でしてみたり(ケミカルのばあい)、プレートや培養液を30度ぐらいでふやしてみたりっていう方法はあるにはある。

とにかく入っている方のプラスミドでインサートの配列が確かめられた方から切り出して入れた方が効率がPCR products よりいいはずだから、それでやり直すのがいいかなと思う。

(無題) 削除/引用
No.3805-8 - 2015/02/02 (月) 14:06:20 - yyy
なんか情報が足りないですね。
「コンピタントセルをligation productでtransformして、pET32bでもpET15bに遜色無い位の数のコロニーが生えてきた」ということで良いのでしょうか？
なのに「ミニプレップしても、pET15bでは出たのにpET32bではプラスミドらしきバンドが全く見られなかった」ということでしょうか？　
コントロールの空のベクターと言うのは「空ベクターで同時にtransformしたセル」から抽出したプラスミドですか？　それとも単に空ベクターを流しただけ、なのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.3805-7 - 2015/02/02 (月) 13:54:56 - AP
in vitroのライゲーション反応にハイコピーもローコピーもないでしょう？

(無題) 削除/引用
No.3805-6 - 2015/02/02 (月) 13:53:27 - AP
いやいや、
精製後のプラスミド濃度なんかは、電気泳動で見るのに十分だったのかと、、

(無題) 削除/引用
No.3805-5 - 2015/02/02 (月) 13:48:04 - ken

APさん

お返事ありがとうございます
pET15bでの構築はできているので
ローコピーであるも考慮した割合での
ライゲーションが行われていると考えます。

(無題) 削除/引用
No.3805-4 - 2015/02/02 (月) 13:22:13 - ken

ぺーぺーさん

早速のお返事ありがとうございます
インサート量や制限酵素、プライマーにつきましては
pET15b、pET32bともに同じものを用いているので
条件としては同じはずなのですが...

(無題) 削除/引用
No.3805-3 - 2015/02/02 (月) 12:57:30 - AP
pETがローコピーだということは考慮されていますか。
pUC, pBlueScriptなどのクローニングベクターに比べると細胞あたりのコピー数が1/20くらい、したがって収量も1/20くらいに下がります。

(無題) 削除/引用
No.3805-2 - 2015/02/02 (月) 12:51:57 - ぺーぺー
すみません。いろいろ前提となる情報を持ち合わせていないのですが。

単にpET15bから切り出して、pET32bに挿入する方法で解決できるんですよね。簡単に思いつく原因がなければ、同じ問題が再発したときに考えれば良いのでは？

簡単に思いつく原因の例：
　・なんかの設計ミスとか（制限酵素の選択、プライマーの設計）……
　・pET32bの制限酵素処理が不十分だった
　・pET32bの脱リン酸化処理が不十分だった（あまり、ありそうにない）
　・インサートの制限酵素処理が不十分で極端に効率が落ちた
　・インサートが沢山入りすぎた

ライゲーションについてです。 削除/引用
No.3805-1 - 2015/02/02 (月) 12:24:23 - ken
酵素発現ベクターの構築のため、
目的遺伝子をPCRにて増幅させた後に
制限酵素　BamHTとNdeTで処理し
pET15bとpET32bを用いてライゲーションを行いました。
コンピはDH5αを用いています。
しかしながらプラスミド抽出を行い
電気泳動にて確認を行った際に
pET15bのみでしかバンドの確認はされませんでした。
どういった理由があるのでしょうか。


追記
コントロールとして流した空のベクターのバンドは現れましたが
pET32bを用いたサンプルのところには
1つのバンドも見られませんでした。

ご教示の程よろしくお願いします。
全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。