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結果 削除/引用 No.3802-8 - 2015/02/07 (土) 15:32:23 - actgnn おおさま 結果が出ました。結局、RIPA bufferとNP40lysis bufferの違いはなく、抗体をMBLの抗V5 monoclonal抗体を試用させて頂いて、IPできました。 293細胞に過剰発現して、落とした結果では、MBL>millipore(rabbit)>>>invitrogen(mono)という結果でした。神経細胞では、MBL>>>>millipore=invitrogenです。 ただ、IP効率が悪いようです。inputの９倍量を落としているはずなのに、バンド的には１／５ほどしかバンドがないため、随分ロスしている印象です。つぎは、RNAのロス具合など違いがありそうなので、短めと長めのincubation時間を比較してみます。いずれにせよ、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3802-7 - 2015/02/01 (日) 11:38:25 - actgnn お返事遅くなり申し訳ありません。 > この手の解析にはRIPAを第一選択に考える人もいます。なぜならマイルドな条件の方がよりprotein complexesを拾う可能性があり、IPした蛋白がほかのRNA binding proteinに結合していて、その蛋白が結合しているRNAを拾っている可能性が高くなるからです。ただIPできないと実験にならないのでmildな条件しか選択しがないばあいもあります。 > 直接かどうかはおいておいて、その蛋白が制御しているターゲットに興味あるなら話はちょっと違ってきます。 おおさま、私たちの興味は、まさにこちらになります。 direct binding partnerを探しておりますので、protein complexの心配はございません。 > RNA binding proteinはものによっては曲者でRIPAとかつかってもいいんですが、塩濃度をあげて抽出ということもよくやられます。特に核にあるものは。 > 核に限らず塩濃度を上げてシンプルなprotein-RNA complexesが取れるなら、IPできるように抗原部位が露出されている可能性もあるし、それでもいいのかなと思えます。 一応、核ではなく、p-bodiesではないかと予想しております。RIPAを試して、だめなら、塩濃度を挙げる等、考慮いたします。 本当に助かりました。感謝申し上げます。 煮詰まったときに、一言声をかけて下さるだけで、石が転がり始める経験を何度もしています。その上、もう一段階上のアドバイスまで頂いて、おおさまを始めお声がけ、本当に感謝します。

(無題) 削除/引用 No.3802-6 - 2015/01/31 (土) 17:54:24 - おお この手の解析にはRIPAを第一選択に考える人もいます。なぜならマイルドな条件の方がよりprotein complexesを拾う可能性があり、IPした蛋白がほかのRNA binding proteinに結合していて、その蛋白が結合しているRNAを拾っている可能性が高くなるからです。ただIPできないと実験にならないのでmildな条件しか選択しがないばあいもあります。 直接かどうかはおいておいて、その蛋白が制御しているターゲットに興味あるなら話はちょっと違ってきます。 RNA binding proteinはものによっては曲者でRIPAとかつかってもいいんですが、塩濃度をあげて抽出ということもよくやられます。特に核にあるものは。 核に限らず塩濃度を上げてシンプルなprotein-RNA complexesが取れるなら、IPできるように抗原部位が露出されている可能性もあるし、それでもいいのかなと思えます。

(無題) 削除/引用 No.3802-5 - 2015/01/31 (土) 16:46:48 - actgnn > まあそうはいってないんですが、NP-40はあんぱいのような気がします。ただ相性が悪い抗体が全くないとはいえないでしょう。キットのバッファーにほかのデタージェントもはいっていてそれが邪魔してないかぁと思った次第です。 おお様 早速ありがとうございます。magnaRIPのMSDSがウソをついていなければ、 NP40単独のようです。それとは別に、sigma-aldrichのRIP assay kitには、mild と harsh bufferが入っていて、恐らく、mildのほうは、non-ionic detergent(NP-40かなにかのみ)そして、harshのほうは、２種類のionic detergent+ non-ionic detergentなので、SDSとdeoxycholateそして、NP-40なのかなと。つまりRIPA bufferを疑っています。 そうすると、蛋白によっては、harshの方が結果が良い場合があるようなので、やはり、目的蛋白の抽出のしやすさに影響を及ぼした可能性があるのではないかとおお様のご意見を参考に考えました。もしp-bodiesや核内にいることが想定されるRBPの場合を考えると、RIPAを試し、RNA回収効率がアウトなら、UV cross linkを考え、蛋白が溶出しなければ、tagがアウトかなと。おっしゃるとおりだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3802-4 - 2015/01/31 (土) 16:29:23 - おお >[Re:3] actgnnさんは書きました : > ご指摘ありがとうございます。 > 通常のIPでは、論文上使用実績があるので、問題ないかと判断しましたが、RIP assay のためですので、 > 後々の、RNA抽出時のことを考えて、キットのプロトコールから外しにくいと判断した次第です。NP40内では、IPできないという条件が存在するとは、経験不足で知りませんでした。 まあそうはいってないんですが、NP-40はあんぱいのような気がします。ただ相性が悪い抗体が全くないとはいえないでしょう。キットのバッファーにほかのデタージェントもはいっていてそれが邪魔してないかぁと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.3802-3 - 2015/01/31 (土) 15:43:47 - actgnn おおさま 貴重なご意見ありがとうございます。 > tagの位置がipに適してなかったのかなぁっていう印象はありますけど。全くないですか?IPフラクションに。 myc tagをC末端に付けたときに、western blotでもワークせず、難しいなと思いました。 rabbit抗体の方でのIPでは、全くなしでした。monoclonal 抗体では、目的近辺にうっすらと、あるかないかです。 > > あとは抗体とbuffer中の特にデタージェントとの相性ですが、IGEPAL-CA630はNP-40ですよね、、、こういったたぐいのバッファーにはRIPAに似た組成にすることがおおいので(deoxycholateまたはchapsと場合によっては0.1%ぐらいのSDSがはいっている)、自身で作ってみてもいいんじゃないでしょうか?deoxycholateとか相性がわるい抗体もあるし、SDSとかデタージェント混液で薄い濃度なら大丈夫ということですが、やはり変性剤なので、、、その抗体でipが可能なバッファーを確認してその組成のものをつくってみるといいかと。 ご指摘ありがとうございます。 通常のIPでは、論文上使用実績があるので、問題ないかと判断しましたが、RIP assay のためですので、 後々の、RNA抽出時のことを考えて、キットのプロトコールから外しにくいと判断した次第です。NP40内では、IPできないという条件が存在するとは、経験不足で知りませんでした。おっしゃって下さっているのは、SDS sample bufferで、完全に変性した直鎖状ならば、抗体が認識してくれることを考えると、少量のSDSを使用することによるNP40+SDSという条件ならば、 落ちてくれる可能性もあるというお考えでしょうか。もしそうであれば、RIP lysis bufferについて是非検討させて頂きます。ChIP grade 抗体を使用することをMilliporeには薦められてしまい、抗体探しで何個も購入は嫌だなと思っおりました。重ね重ねありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3802-2 - 2015/01/31 (土) 11:24:59 - おお tagの位置がipに適してなかったのかなぁっていう印象はありますけど。全くないですか?IPフラクションに。 あとは抗体とbuffer中の特にデタージェントとの相性ですが、IGEPAL-CA630はNP-40ですよね、、、こういったたぐいのバッファーにはRIPAに似た組成にすることがおおいので(deoxycholateまたはchapsと場合によっては0.1%ぐらいのSDSがはいっている)、自身で作ってみてもいいんじゃないでしょうか?deoxycholateとか相性がわるい抗体もあるし、SDSとかデタージェント混液で薄い濃度なら大丈夫ということですが、やはり変性剤なので、、、その抗体でipが可能なバッファーを確認してその組成のものをつくってみるといいかと。

RIP assayに使用する抗体について 削除/引用 No.3802-1 - 2015/01/30 (金) 17:58:09 - actgnn お世話になります。みなさまのお知恵を拝借したく思います。 RIP assayを行う予定ですが、第１ステップでつまづいています。 V5tagをつけた180kDa程の蛋白を神経細胞にnucleofector を用いて過剰発現し（５０％IRES GFP発現有り、10cm dish一枚）、V5抗体によりIP（MagnaRIPというキット使用）するのですが、きちんと蛋白は発現していることがinputのバンドとして確認できるのですが(500ul lysis buffer中20ulアプライでドカンとバンド有り)、困ったことに、目的蛋白をIPできたという証拠が得られません。（最後のステップでビーズを500ulに再溶解して、そこから50ulを取り出して、ビーズから1X sample bufferでボイルして溶出）IPに5ug使用した抗体のIgのバンドはどかんとみられるため、ビーズ、抗体の結合は問題無さそうです。そうすると、論文で使用実績のある、invitrogenやmilliporeの抗体が蛋白を落とせないという結論になります。RIP lysis bufferは、濃度は不明ですが、IGEPAL-CA630,KCL,MgCl,HEPESとMSDSからは読み取れるので、恐らく普通のlysis bufferということになります。抗体量、蛋白量などを検討する必要がありますでしょうか。すみませんが、お知恵を拝借できると幸いです。よろしくお願いいたします。

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