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感謝 削除/引用 No.3799-16 - 2015/02/01 (日) 23:41:55 - たけのしっぽ MPさん ありがとうございます。 pYAP　スキムミルクのOvernightのブロッキングやってみます。 本当に感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3799-15 - 2015/02/01 (日) 10:04:18 - MP ミルクでのブロッキングが問題になるのは、たしかanti-phospho tyrosine 抗体だったと思います。

感謝 削除/引用 No.3799-14 - 2015/01/31 (土) 22:56:52 - たけのしっぽ ありがとうございます。 ほぼ毎日何らかのWBをやっているのですが、この二つの抗体だけがやっぱりバックが高くなってしまいます。 ですので おおさんがご指摘のように抗体の変性も否定できませんが、一発目からだったのでどうしたものか。 MPさんに書いていただいた、O/Nでのブロッキングはしっかりブロッキングできそうですね、しかしリン酸化を見る抗体ですが、ミルクでも大丈夫だったのでしょうか？ 一人で孤軍WBをやっていますので、本当にたすかりました。 洗浄を回数時間を増加するのと、抗体濃度をすこし下げてみます、発色基質も下げてみます。 おなじCSTの抗体でもいろいろと抗体によって違いがあるような気がしてなりません。

(無題) 削除/引用 No.3799-13 - 2015/01/31 (土) 18:01:10 - おお あ、あとわたしはwashは通常長めです、4回ぐらい洗いますが、何かの実験の合間にやることが多いので合計で2時間ぐらい洗ってると思います。ラボの研究助手が洗いを15分3回でやってて若干バックグランドが高かったのでもう一回増やすようにしてもらったらかなりきれいになったこともあります。

(無題) 削除/引用 No.3799-12 - 2015/01/31 (土) 15:21:56 - MP その抗体（4911）なら使ったことがあります。 PVDFにセミドライで転写、５％スキムミルクでO/N 4度でブロッキング。1次抗体（1：2000くらい？）2次抗体（1：10000）いずれもCan Get Signal使用。検出は確かECLplusでやった気がする。O/Nブロッキングは1次抗体の反応性がおちることがあるので、ブロッキングのあとはよく洗ったほうがいいかも。

(無題) 削除/引用 No.3799-11 - 2015/01/31 (土) 08:00:47 - 774 他の人が指摘しているように、全体が黒くなるのは、 2次抗体（濃度or変質）とケミルミ試薬のどちらかが原因ではないでしょうか。 1次抗体だけを変えてうまく検出できてますか？

(無題) 削除/引用 No.3799-10 - 2015/01/31 (土) 05:12:37 - おお 自家製の非蛋白性ブロッキング液をつかってます。おそらく使っているケミカルは同じか、一部同じとおもいますが良好です。 ほかのかたものべてますが、同時に抗体量をさげるといいかとおもいます。というのもお示しのプロとコールで大抵はそんなにひどくならないので。なので抗体の濃度があなたの今の検出系にあってないんだと思います。まあ感度のひくいECLでもいいですけど。

(無題) 削除/引用 No.3799-9 - 2015/01/31 (土) 01:24:21 - み 上手く検出できている一次抗体はあるのでしょうか？ あなたの今の方法では何の抗体でも結果は同じでは？ 膜の全体が真っ黒になるのならブロッキングの問題と二次抗体の濃度とwash不足とｹﾐﾙﾐがﾌｪﾑﾄという高感度のせいだと思う。 今の方法なら一次抗体なしで、ブロック、二次抗体、wash、検出だけでも真っ黒になりそうな気がする。

(無題) 削除/引用 No.3799-8 - 2015/01/30 (金) 21:51:49 - 名無し 抗体が変性している可能性が一番有りうるように思う。これだと買い替えるしかない。Blocking剤に含まれる何かと抗体が反応していることも割りと多い。BSAとかミルクケーシンとかの主要成分よりも、それにコンタミしてるなんかよくわからない微量蛋白質成分と反応していることが多いみたい。あとこれは有名なのでみんな知ってるとおもうけどリン酸化アミノ酸残基（特にセリンはヤバい）に対する抗体はとりあえずスキムミルクは×。あとなんかの蛋白質のリン酸化部位に対する抗体のウェスタンのデータでTris budderかPBSか、とか、ちょっとした塩濃度の違いでもBGや抗体の反応がほらこんなにちがうのですよ、みたいな写真をみたことある。 ブロッキング剤の成分に起因するウェスタンでのトラブルを解決するため、protein freeの調製済みブロッキング溶液が売られている。実際にそれでかなりバックがきれいになったことがある。試してみるといいとおもう。

感謝 削除/引用 No.3799-7 - 2015/01/30 (金) 21:22:34 - たけのしっぽ みなさんありがとうございます。 バックグラウンドはメンブレン全体ががーと発色します。 感度の低いものに変更する手もやってみます。 どなたかタンパクの入ってないPerfectBlockなどを使用されていらっしゃるでしょうか？ お教えいただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3799-6 - 2015/01/30 (金) 16:14:46 - おお リン酸かをみているのでしたら、ミルクとかバックグランドの原因になるかもしれません。 単純に抗体の濃度を下げるてもありますよ。推奨プロとコール通りやっていても感度の高いECLキットを使うとバックが高くなるでしょうし。逆に感度の高くないECLにかえてもいいかも。 あとバックグランドといっても、膜全体が暗くなるのか、レーンにノンすぺのバンドがでるのかどちらでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3799-5 - 2015/01/30 (金) 15:44:49 - mon InvitrogenのiBlot ver1＠PVDF膜−＞HRP-ケミルミで検出しています。 BSAやPerfect Blockでは1時間ブロッキングしてもバックグラウンドシグナルが高くて汚かったですが、５％Skim milk/PBS-T 15分でほとんど~全くバックグラウンドシグナルが出なくなりました。 Skim milkは古くて固まって黄変していたGIBCO(だったかな）ブランドですが、問題ないです。しかも溶けきらないので上澄みを使っています。 セミドライ転写+Immnobilon-PVDFではそのようなことがなかったので、？？です。

(無題) 削除/引用 No.3799-4 - 2015/01/30 (金) 15:28:18 - ~ その抗体を使ったことがないので一般論になりますが、 BSAがだめなら、 ・スキムミルク ・市販のブロッキング剤 ・ホストの血清 あたりが次の候補でしょうか。 手元に２次抗体の希釈用の5%スキムミルクがあるようですので、 まずはそれを試してみては？ また、シグナルが強く出ているであれば、1次抗体をO/Nではなく、 数時間にしたらバックグラウンドが弱くなりませんかね。

(無題) 削除/引用 No.3799-3 - 2015/01/30 (金) 15:17:10 - 独り言 とりあえず５％Skimmilkでしょ。雪印の食品用でもいいからskimmilkはどこでも手に入る。

(無題) 削除/引用 No.3799-2 - 2015/01/30 (金) 14:31:29 - おお https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314716762536/litdoctt136_20110830181538.pdf PVP(polyvinylpyrrolidone) 1%ぐらいいれると有効かもしれません。

WBのバックグラウンド 削除/引用 No.3799-1 - 2015/01/30 (金) 11:20:58 - たけのしっぽ いつも参考にさせていただいております。 WBのバックグラウンドに悩まされております。 特にCSTのpYAP(#4911)とTAZ(#2149)です １、タンパクは培養細胞からlysate Bufferで抽出。 ２、SDS-PAGE　1レーン20ug　ロードしました。 ３、IBLOT2 ドライ式転写をPVDFにおこないました。 ４、ブロッキングは５％のBSA＋TTBS。 ５、1次抗体の希釈液も５％のBSA＋TTBS。4度 Overnight。 ６、WashはTTBS Tween　5分　4回。 ７、２次抗体の希釈液も５％のNon Fat Skim milk。 ８、WashはTTBS Tween　5分　4回。 ９、発色はThermoFisherのWestFemtoです。 CSTに問い合わせたところ、転写をセミドライにしたほうがいいとかPVDFからニトロセルロースに変えたほうがいいなどの返答がありました。 あまり手技を抗体ごとで変えたくないのですが、どなたかブロッキングバッファーで改善する方法をごぞんじないでしょうか？ よろしくお願いします。

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