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(無題) 削除/引用 No.3788-18 - 2015/01/28 (水) 16:27:48 - 中年 すみません。「脱落は分裂あたり1%以下」はオーダーを示したわけではなくて、1%よりずっと小さいというつもりでした。

(無題) 削除/引用 No.3788-17 - 2015/01/28 (水) 15:33:14 - AP >（脱落は分裂あたり1%以下） そんなに高いのっ、ていう印象なんですが。 一分裂あたり最大で1%ずつF因子が失われるとしたら、 たとえば8時間培養してその間に30回分裂したとすると、 約1/4の細胞はF因子を失うことになるとおもうんですが、 計算違い勘違いしているかしら、

(無題) 削除/引用 No.3788-16 - 2015/01/28 (水) 15:22:23 - AP というのは液体培養でコンピーテントセルをつくるところでしょうか、グリセロールストックからスローリークしてシングルコロニーをとる場面でしょうか。 いずれにせよDH5alphaでもSOBの使用が必須ということはないですね。高効率のコンピを作るにはSOBやSOCがいいといわれていますが、coverageの高いライブラリーをつくろうというならともかく、日常的な単一断片もクローニングのような目的ではプラクティカルにはLBや2xYTでも十分です。 JM109はストリークして単位コロニーを拾うところではM9 plateで選択をしますが、コンピを作るための培養な通常の培地（SOB、LB）でやるのが普通だと思います。理想的にはM9でやるのがいいのでしょうけれど、増えにくいとかで実用的ではないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3788-15 - 2015/01/28 (水) 14:40:26 - 中年 F因子自身に分配されるための機構が備わっているのでそこそこ安定ではありますが（脱落は分裂あたり1%以下）、だからといって選択ゼロで植え継ぐことは安全のためにも避けるべき。コンピテントセルを作るための培養をM9で行うと形質転換効率が落ちるのでこれも避けるべき。現実的には、M9プレートにストリークして生えてきたシングルコロニーからスタートして、液培のステップはSOBで行うというのが落としどころかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3788-14 - 2015/01/28 (水) 14:18:03 - AA >>大腸菌で組換え実験をするのなら、それくらい勉強しておかないとダメ 不勉強を晒してしまい大変恥ずかしいばかりです。 当方DH5alpha以外の使用経験がなく、あまり勉強しておりませんで、 エピソームの脱落がどの程度の頻度で起きるのか知らず聞いてしまいました。 プロメガHPでJM109の説明などを見ても、 F'因子の維持には最少培地で培養せよ、と書いてあるので、 それなりに高頻度で起きてしまうのではと理解致しました。 今後F因子で耐性や栄養要求性の変わる株を使う時は注意したいと思います。 DH5alphaがF-株であることは承知しております。。 「DH5aならSOBを用いるところを、JM109ならM9に置き換えるべきなのか？」 という質問でした。 文章の書き方も悪く、混乱させてしまいすみません。

(無題) 削除/引用 No.3788-12 - 2015/01/28 (水) 13:54:43 - AP 肝心なこと言い忘れました。 >DH5alphaは、F'因子をもちません　(F-)。lacZomegaは、phi80ファージによってゲノムに挿入されています（Φ80dlacZΔM15）。 なのでM9での選択は意味がないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3788-11 - 2015/01/28 (水) 13:46:55 - AP F因子はstringentなレプリコンで一細胞あたり2,3個くらいじゃなかったかしら。 それくらいコピー数が少ないと、細胞分裂のときに両方の姉妹細胞にうまく分配されないことも容易に起こるわけで、F因子はを失う娘細胞も出やすいと考えられましょう。そういうことハイコピーのプラスミドだって起こりうるのですから。

(無題) 削除/引用 No.3788-10 - 2015/01/28 (水) 13:25:18 - AP >DH5aならSOCで増やすところをM9培地で増やすべきということでしょうか？ JM109のF'にはプロリン非要求性となるproAB+が乗っているので、アミノ酸を含まない最少培地で選択できます。 XL1-BlueなどではF'にさらに薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン抵抗性等）が乗っていますので、M9を使わなくても薬剤で選択できます。 DH5alphaは、F'因子をもちません　(F-)。lacZomegaは、phi80ファージによってゲノムに挿入されています（Φ80dlacZΔM15）。F'がないのでその上にのっているlacI^qもありません。したがってlacプロモータは恒常的にONなので、青白選択の時にIPTGによる誘導が必要ありません。逆にlacプロモータで発現する発現ベクターの構築の時に使うと、導入遺伝子がかってに発現して毒性を示し、目的のコンストラクトが取れない可能性があります。 てゆうか、大腸菌で組換え実験をするのなら、それくらい勉強しておかないとダメなんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.3788-9 - 2015/01/28 (水) 12:06:27 - 意地悪なコメント L-plateって何ですか？ 抗生物質なしですか？ コンラージ棒で菌液を塗り付けたのでしょうか？ コンラージ棒が滅菌されてなくて、環境中の細菌も一緒に塗り付けた可能性も否定できない。

(無題) 削除/引用 No.3788-8 - 2015/01/28 (水) 11:27:21 - mon >[Re:7] AAさんは書きました : >便乗質問で申し訳ないのですが、JM109はエピソームを落としてしまうということで> すが、 自分で増やしてケミカルコンピにしたい場合、DH5aならSOCで増やすところを M9培地で増やすべきということでしょうか？ F因子は不安定ではないので、SOBで増やしても問題無いです。 気になるなら前培養をM9培地にすれば良いです。 運が悪いとたまたま拾ったシングルコロニーがFを落としたものである可能性がありますので、たまにM9培地で増やしておくと安心です。 凍結した菌をいきなりM9培地で増やすと増殖に時間がかかるので、LB等で一旦増やして、ごく少量をM9培地に植菌すると良いでしょう。 またM9培地+10%Glycerolで凍結すると生存率が悪かったような記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.3788-7 - 2015/01/28 (水) 11:16:25 - AA 選択圧のかかっていない培地に液体培地で100ulもまけば当然かと思います。 (ちなみに今回の見た目をよく覚えておかれると、今後抗生物質に異常のあった時の目安になると思います) 既に指摘されていますが、画線培養するのが適当でしょう。 便乗質問で申し訳ないのですが、JM109はエピソームを落としてしまうということですが、 自分で増やしてケミカルコンピにしたい場合、DH5aならSOCで増やすところを M9培地で増やすべきということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3788-6 - 2015/01/28 (水) 09:41:32 - AP コロニーを分離するのに、なぜそういう手順を踏んでいるのか、なにか特別の目的があるのか、理解できません。それだったら、液体培地に接種しないで、寒天培地にストリーク（streak)するのが常道ではないですか。 LB液体培地で定常状態まで培養したら2-3 OD600/mLくらい、つまり10^9 cfu/mL以上にはなっているでしょう。100 uLもまいたらプレート上に１億細胞くらいいることになります。 なお、JM109はLB培地で増やすとF'因子が失われていきます。F'因子にはLacZomegaなどがありますので、クローニングに宿主として使用する目的なら( 特に青白選択するなら）最少培地であるM9培地を使う必要があります。 それとインターネット上では日本語フォントの特殊文字は通りませんから、マイクロリットルならuLのように半角英字を使うようにしましょう（ギリシャ文字は英字と同じ扱いになるので（ギリシャ文字マイクロはインターネット上ではmと同じ）マイクロはuであらわすといいでしょう。

WB re-probing 削除/引用 No.3788-5 - 2015/01/28 (水) 08:22:54 - おお Hint 画線培養 ttp://www.setsunan.ac.jp/~p-bisei/Lecture_files/YTII2013-2.pdf ttp://www.kyotogakuen.ac.jp/~microbio/news/2011/11/000134.html 培養溶液からシングルクローンを拾う方法の一つですが、あなたの目的がそうでなければこの方法がその目的に合っているかはわかりません。 たとえば培養溶液中の菌の数を決めたいなら、これでははかれませんから。

(無題) 削除/引用 No.3788-4 - 2015/01/28 (水) 08:01:32 - TK-1 仮にOD600=1として（full growthならもっと高いかもしれませんが）、〜1x10^9 cells/mlです。100 microlitterで10^8。これだけの菌数をプレートのまけばどうなるか想像してみてください。 なぜわざわざ、platingの前にliquid cultureをやる？こんなところで聞いているより教科書を読んだ方がいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.3788-3 - 2015/01/28 (水) 08:01:20 - y フルグロースが何を意味しているかわかりませんが、濁るくらい前培養したものをプレート全体にまいたのならそれは多すぎです。 普通は白金耳とかで段階的に希釈してのばしますよね。 本当の初歩的な動作も知らない状態で実験するのは危険ですよ。 ちゃんとラボの人に教わってから実験してください。

(無題) 削除/引用 No.3788-2 - 2015/01/28 (水) 06:53:58 - おお 100 micro-litterでしょうか。もしそうだとしたら多いかどうか知る余地もありません。 10個大腸菌がいれば10個コロニーが生えてきます。 100 micro-litterに何個大腸菌がいたんですか?

E.coliJM109のプレーティング 削除/引用 No.3788-1 - 2015/01/28 (水) 06:43:17 - もりりん この前、E.coliJM109のコロニーを得るためにL-brothでフルグロースにした培養液をL-plateに１００㎕プレーティングしました。 その後プレートを３７℃オーバーナイトインキュベートしたところコロニーではなくプレート全体の色が濁るように生えてきました。 １００㎕では多すぎるのでしょうか？

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