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(無題) 削除/引用 No.3778-17 - 2015/01/28 (水) 17:42:45 - AP >プレートにスプレッドする量はどのくらいがいいのでしょうか？書籍を参考に 現在は10μlほどまいています。 経験が乏しいうちは、10倍くらいの希釈列で三段階くらいまくのがいいと思います。使用するベクターの種類や量、ライゲーション効率、形質転換効率など実験ごとにことなるし、楽勝なのから高難度のものまであります。そんなこんなでcfuでかるく３桁以上ばらつきがでますので、オールマイティーなスプレッド量はありません。まく量を段階的に振ることでコロニー数が正確に数えられるので、実験系の評価（形質転換効率など）ができます。そうして、経験をつむことで実験パラメータがどういう結果をもたらすかということがわかってきます。 コンスタントにうまくいくようになって、ルーチンでやるようになったら手抜きを憶えて効率とスピード重視にしてもいいです。 たとえば、プレーティングは一枚だけ、プレート面の半分くらいに塗れるだけ塗って（たとえば200 uL), 後の半面はスプレッダに残ったわずかの菌液がかすれるくらいに塗ります。そうすれば、多めにまくことで形質転換効率が低くてもコロニーが出てくる可能性が高まるし、コロニー数が多いときでも薄く塗った方で単一コロニーが分離できます。ただしコロニー数の勘定は明まなければなりませんが。

あれ？ 削除/引用 No.3778-16 - 2015/01/27 (火) 09:42:11 - ~ Inverse PCRで配列を加えようとしていると思っていましたが、 pAcGFP1 ベクターは5'MCSにHindIII認識サイトがありますね。 これはまだ生きているのでしょうか？ 生きている場合、何をしているのかがまだ分かりません。 ベクターをテンプレートにしたPCRで、 5'-nnn-aagctt-ベクター配列-シグナル配列-(6塩基の付加配列？)-aagctt-nnn-3' という直線状のPCR産物を作り、これをHindIIIで切り、 5'-agctt-ベクター配列-シグナル配列-(6塩基の付加配列？)-a -3' 3'- a-ベクター配列-シグナル配列-(6塩基の付加配列？)-ttcgaa-5' というフラグメントにして、アガロース電気泳動で元のベクターと分離して精製し、 ライゲーションして環状にしているのではないのでしょうか？ それとも、別のプライマーで配列を付加していて、HindIIIはテンプレートのベクターを切って形質転換に持ち込まれないようにしているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3778-15 - 2015/01/26 (月) 23:33:13 - おお ベクターはきってアルホス処理はしてますよね。。。 してなくって全くコロニーが生えないならligation transformationの系がワークしてない可能性も。 PCRプルダクトはゲルから切り出してますか?また量は測っているでしょうか?極端におおいとtransformation の効率がガクンとさがります。プラスミドから切り出したものであればそう言うことはあまり起こらないですが、PCR puroductsはまあ増幅で必要ないほど増えてしまいますので。

(無題) 削除/引用 No.3778-14 - 2015/01/26 (月) 23:25:15 - おお 平滑化が必要でしたというオチだったりするか?

(無題) 削除/引用 No.3778-13 - 2015/01/26 (月) 21:30:30 - おお PCR PCR productsもHindIIIできってるんですよね、、、そうじゃないとはいらないですからね。あと指摘があるようにちょっとプライまーの設計が不思議ですね、、、どうなってるんだろうと。 Ligationしたあとは濃度をあわせなくても10-50ng入れるといいです。たとえば5ulで10ngあれば50ulのコンピにくわえて、ヒートショック、on iceごSOCを250ul加えれば大腸菌が大過剰ない限り全量一枚のプレートに余裕でまけるとおもいます。

おそらくは本質ではありませんが 削除/引用 No.3778-12 - 2015/01/26 (月) 20:07:31 - ~ >プレートにスプレッドする量はどのくらいがいいのでしょうか？ コロニーが1個も取れていないのですのね？ せっかく作った形質転換体を捨てている場合ではないでしょう。 プレート1枚は10uL撒いてもいいでしょうけれども、 残りはよく乾かしたプレート1枚に全量撒いてしまいましょう。 10uL中には当たりが0個でも、1000uL中には数個位あるかもしれません。 そんな低い確率に期待しなくてもいいようなベクターコンストラクションをしろと 言われるかもしれませんが、当たりが取れれば次に進めますので、 取れるのであれば取ってしまいましょう。

(無題) 削除/引用 No.3778-10 - 2015/01/26 (月) 19:59:48 - ~ とりあえず、プライマーの配列が、 nnn-aagctt-ベクターに結合する配列 または、 nnn-aagctt-ベクターに付加する6塩基-ベクターに結合する配列 となっていますかと言われたら、何のことか通じますか？ ベクターに付加する6塩基がHindiii 認識サイトであれば、 17merのプライマーでも8mer分がアニールするので、 ベクターがテンプレートなら行けると思います。 ただ、別の場合、3+6+6=15merが指定で、 ベクターにアニールするのが3merというのは 無理がありますよね。

(無題) 削除/引用 No.3778-9 - 2015/01/26 (月) 19:37:07 - なつ まだ初心者でして至らない文章ですみません。 pAcGFP1にコラーゲンのシグナル配列が挿入されたベクターの、シグナル配列の後ろ側に6塩基ほど配列をインサートすることを目的にプライマー設計をしています。プライマーは17bpでTm値は58ほどです。 ベクターの制限酵素処理はHind　�Vにてしています。 PCR後にアガロースゲル電気泳動しゲルを抽出、ゲル抽出液を最終的に30μlになるようにし、ライゲーションをゲル抽出液を5μl、ligation highを5μl、T4 kinaseを1μl、滅菌水を4μlにて行い、 トランスフォーメーションはコンピ100μlを氷上融解させライゲーション液を10ng/μlになるよう水で薄めて10μl入れ、氷上30分、42℃で45秒インキュベート、氷上に戻し2分のち37℃で温めておいたsocを500μlコンピへ入れ37℃で45分インキュベートしAmpを含むLBプレートにスプレッドし37℃でオーバーナイトさせています。 プレートにスプレッドする量はどのくらいがいいのでしょうか？書籍を参考に 現在は10μlほどまいています。

(無題) 削除/引用 No.3778-8 - 2015/01/26 (月) 14:25:12 - おお PCR productsとかであれば、末端の状態、制限酵素処理の難しさなどもありますし、そう言うところも書いてないからどうアドバイスしていいかもわからないですけど、、、 すべての過程で問題なくとも取れないということもまれにあるので、そうなるとconstructionのデザインを変更というのもありますし、、、

(無題) 削除/引用 No.3778-7 - 2015/01/26 (月) 12:04:43 - ~ >pAcGFP1に配列を少し加えようとしています。 配列の挿入方法が妥当でなければ、形質転換時にコロニーが生えてこなくてもおかしくありません。 ベクターの構築については、下記のようなステップがあるかと思います。 �@ベクターの設計 �A制限酵素処理（ライゲーションということは切り貼りするのですよね？） �B電気泳動→切り出し �Cライゲーション �Dトランスフォーメーション 一連の操作の妥当性はどのように確認していますか？ コロニーが生えない原因がどこかのステップでの不適切な操作であったとしても、 情報がない以上、どこに問題があるかは誰も答えられないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3778-6 - 2015/01/26 (月) 02:01:48 - おお バックグランドのコロニーさえでないのであれば、コンピの効率もちょっと心配ですが、、、 配列を加えるというのは何かinsertするのですか?それともmutagenesisみたいな感じですか? ベクターを見るとC-terminalにGFPのタグが入れれるような構成になってますが。。。

(無題) 削除/引用 No.3778-5 - 2015/01/25 (日) 21:17:21 - 名無し たぶんライゲーションがうまいこといけてないのだとおもいます。試薬や条件など、慣れている人に相談して、一度、全工程を一緒にやってもらうのが早いとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3778-4 - 2015/01/25 (日) 19:57:19 - み 文章だけから判断しても未熟すぎる。 このような質問をしているヒトが適切な指導なしに組換え実験を行っても良いのか疑問です。 指導的立場にあるヒトは助言や指導なしに勝手にやらせているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3778-3 - 2015/01/25 (日) 19:28:56 - AP そういうときは、基本に立ち返って、教科書通りのコントロール各ステップで設けてやってみるべきでしょう。サブクローニング、形質転換などはルーチン化していて、プラクティカルにはいちいちコントロールはとらないですが、トラブったらそうするのが一番。第一、質問にあげられている情報だけでは原因が限りなく考えられて、それをいちいち列挙したり、試してみたりするのは大変です。 もっとも、最初から本実験の方法だけ教えられていて、どういうコントロールをとったらいいか分からなかったり、あるいはコントロールを取るという発想自体が若者もいますけれどね。

(無題) 削除/引用 No.3778-2 - 2015/01/25 (日) 18:42:28 - なつ ng/μ&#8467→ng/μlです。

形質転換時にコロニーの発生しません 削除/引用 No.3778-1 - 2015/01/25 (日) 18:37:05 - なつ 実験にて形質転換時にコロニーが確認できません。 pAcGFP1に配列を少し加えようとしています。配列長は3kbpほどです。 ゲル抽出時にUVをあまり当てないようにし、耐性もアンピシリンで間違えていないと考えています。 形質転換時にライゲーション後の濃度は50ng/μℓほどなので10ng以下になるように水で薄めて10μℓをコンピテントセルに加えています。 ほかの研究者のベクターではコロニーの発生が確認できていますのでコンピテントセルの形質転換効率は大丈夫ではと考えています。 もう5〜6回ほど繰り返していますがコロニーが発生しません。形質転換のプロトコールも本を参考にし少しずつ変更したりしているのですが結果変わらずです。 どなたかご教授していただければ幸いです。

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