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(無題) 削除/引用 No.3777-6 - 2015/01/25 (日) 14:25:34 - おお >[Re:5] 774Rさんは書きました : > なお、断端が相補的でない2種類の制限酵素の場合、脱リン酸化は不要。というかしないほうがいい。 基本そうなんですが、一方の酵素が完全消化できなかった場合、selfがでてきて、insertなしコントロールをとらないで原因が特定できないということもあり得るので、あまりなれてないセンスがついてない人そのまま鵜呑みでやってしまうとどうかなぁという気もします。酵素によっても切れ味が違いますし、その辺も経験がものを言うかもしれません。

ベクターの調製は 削除/引用 No.3777-5 - 2015/01/24 (土) 15:37:43 - 774R 制限酵素処理→脱リン酸化→電気泳動→回収 が一番だと思います。 なお、断端が相補的でない2種類の制限酵素の場合、脱リン酸化は不要。というかしないほうがいい。 挿入の向きも決まる、コンストラクトをデザインするときはなるべく2種類の酵素を使う。

(無題) 削除/引用 No.3777-4 - 2015/01/24 (土) 15:12:59 - おお 一応ですね、シリカを使うような膜をつかったカラム(カラムっていうんだろうか、、、)では、グアニジンを使うやつと、KIを使うやつがあるのではと。前者の方がいまはポピュラーで、グアニジンはかなり強力な変性剤だから、カラム通したら蛋白は無視できるようになるような状態かとおもえるのです。もう一方の方はそこまで変性能力はつよくないと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.3777-3 - 2015/01/24 (土) 14:01:21 - おお カラムでもよさそうだけど、TAKARAに聞いてみたらどうかと、、、カラムでも活性が残るというデーターでもあるのかしら。

(無題) 削除/引用 No.3777-2 - 2015/01/24 (土) 13:37:21 - mon スピンカラムはゲル濾過カラムか、シリカメンブレン等の吸着カラムかで話は異なるかと。 また、なかなか失活しないBAP時代の名残かなと思います。 熱安定性が低いアルフォス(例えばSAP）なら制限酵素処理と脱リン酸化処理を同時に行い、熱失活（あるいはゲルからの切り出し）でligationに持ち込むのが省力化できるので良いと思います。 なお、私はハズレクローンを少なくするためゲルからの切り出し・精製を多用します。

フェノクロ沈かspinカラムで精製か 削除/引用 No.3777-1 - 2015/01/24 (土) 12:32:13 - feno 今、Takaraのクローニング実験ハンドブックを見てるんですが、 クローニングの際にvectorを制限酵素で切断後、スピンカラムでDNAを精製 その後、アルフォスで脱リン酸化処理して、フェノクロ沈する と書かれてあります。アルフォス処理後もスピンカラムでDNAを精製すればいいのではないかと思うんですが、それだけではアルフォスを完全に除かれないということでしょうか？ フェノクロ沈が第一選択でしょうか。

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