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ISHのプローブ合成 トピック削除
No.3775-TOPIC - 2015/01/23 (金) 15:00:13 - シジュルカ
いつも参考にさせて頂いております。

現在ISH用のRNAプローブを作製しているのですが、TAクローニング後のシーケンスで10/11個の割合でインサートが逆向きに入っていました。
以前にSP6ポリメラーゼでの増幅はT7のそれよりも注意しないといけないといった内容のレスを見た記憶があります。そこでお聞きしたいのですが、SP6ポリメラーゼがT7よりも不具合があるのか、その場合はどういった内容なのかお教えいただけないでしょうか。
　
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No.3775-7 - 2015/01/26 (月) 09:29:40 - mon
何気にNEBのカタログを眺めていたら、
T7 RNA polは37℃、SP6 RNA polは40℃で反応となっていました。
SP6 RNA polも37℃で反応させていたのが、収率が低かった原因かも？

(無題) 削除/引用
No.3775-6 - 2015/01/24 (土) 14:02:45 - mon
＞今回はほとんどのサンプルが逆向きに入っていたので、SP6ポリメラーゼの評判が気になり質問させていただきました。
やはり、そうでしたか。失礼しました。
同じ配列で比較したわけではないですが、SP6の方が総じて収率が低かった10年以上前の記憶がありますが、今はそんなこともないでしょうね〜？

(無題) 削除/引用
No.3775-5 - 2015/01/23 (金) 21:17:28 - AA
APさんの指摘の通り、RocheのDIGラベルキットにデフォルトで入っているのはSP6とT7です。
RocheはDIG labelingの権化みたいな会社ですので、SP6の評判は推して知るべしといったところでしょう。
私も使いますが全く問題は無いです。

T7とSP6で挟まれててTAクローニングというとpGEM-Tシステムあたりが思い当たりますが、
どっち向きでも配列が正しいものであれば特に気にせず使えます。

(無題) 削除/引用
No.3775-4 - 2015/01/23 (金) 19:06:26 - AP
なんかそういう投稿を見た記憶はあるのですが、
わたしは、SP6だといって悪いこと無いと思います。T7/T3より収量がよくて好きなくらいです。たしかRocheのDIG RNA ラベルシステムで採用されているのはSP6/T7じゃなかったですか。SP6に問題があるなら自信を持ってお勧めされないと思います。

ところで、逆向きの頻度が高いということですが、Lacプロモータとインサートの転写方向がそろっているものは、経験的に形質転換体がでにくいです。ベクターはなんでしょうか。lacZがなく、blue/whtie selectionを意図しない設計のベクターでも、ベースとなったプラスミドのLacプロモータの痕跡が残っているものもあるようなので。

問題なく反応すれば、鋳型のインプットに対して10倍以上のアウトプット(RNA)ができるので、増幅と言えないこともない。

(無題) 削除/引用
No.3775-3 - 2015/01/23 (金) 17:15:07 - シジュルカ
mom様

混乱させる文脈で申し訳ございませんでした。
TAクローニング後に逆向きにインサートされたものはSP6ポリメラーゼ、そのままインサートされたものはT7ポリメラーゼを使って最終的にRNAプローブ合成の予定です。
今回はほとんどのサンプルが逆向きに入っていたので、SP6ポリメラーゼの評判が気になり質問させていただきました。

(無題) 削除/引用
No.3775-2 - 2015/01/23 (金) 16:22:46 - mon
汎用されるSP6ポリメラーゼはRNAポリメラーゼですので、DNAの増幅には使用しません。
何か勘違いしていませんか？

ISHのプローブ合成 削除/引用
No.3775-1 - 2015/01/23 (金) 15:00:13 - シジュルカ
いつも参考にさせて頂いております。

現在ISH用のRNAプローブを作製しているのですが、TAクローニング後のシーケンスで10/11個の割合でインサートが逆向きに入っていました。
以前にSP6ポリメラーゼでの増幅はT7のそれよりも注意しないといけないといった内容のレスを見た記憶があります。そこでお聞きしたいのですが、SP6ポリメラーゼがT7よりも不具合があるのか、その場合はどういった内容なのかお教えいただけないでしょうか。
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