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(無題) 削除/引用 No.3771-7 - 2015/02/04 (水) 18:44:47 - もぐら 解決済みとのことですので、必要ないかもしれませんが。 シグナルの真偽が心配であれば、ノックダウンか過剰発現したサンプルを調べる、あるいは、未処理のサンプルでペプチド吸収などをしてみてはいかがでしょうか。ノックダウンで綺麗に消えれば、心配が軽減されるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3771-5 - 2015/01/23 (金) 16:44:36 - megu AP 先生、おお 先生 拝啓 御多忙の中、早速にご意見を頂き本当にありがとうございました。 塩酸で処理することは問題ないとのこと、御陰様でとても安心致しました。 もちろん対象とするサンプル、タンパク質ごとに確認することが必要、とのことかと思います。 AP 先生におきましては、DNase I 処理という代替案をご教授頂きまして本当に勉強になりました。早速、いろいろ調べてみたので、是非試してみたいと思います。 それにしてもこの掲示板で AP 先生やおお 先生ならびにたくさんの方々、そしてもちろん管理人様のおかげで救われた人は多いのではないでしょうか。さぞかし高名な先生方かと推察致しますが、直接に御礼を申し上げることが出来ず歯がゆいばかりです。どうかこれからも宜しくお願い申し上げます。本当にありがとうございました。 敬具

(無題) 削除/引用 No.3771-4 - 2015/01/22 (木) 21:17:58 - おお 一般論として、塩酸で処理しても抗原性が維持されていても何ら不思議ではないです。

(無題) 削除/引用 No.3771-3 - 2015/01/22 (木) 19:19:32 - AP >敬具 このような場で「敬具」とは恐れ入るな、でもそれなら「背景」からはじめなきゃ、と思ったけど >★背景 というのはあった。

(無題) 削除/引用 No.3771-2 - 2015/01/22 (木) 19:14:55 - AP >「塩酸処理をしたにも関わらずタンパク質を免疫染色できる」（と自分には思われる）ことは、科学的に受け入れられること（普通なこと）なのでしょうか？ ありえます。それで抗原性がなくなるか、変わらないか、よくなるか、は組織、タンパク質、固定などによってことなるでしょう。 だって、タンパク質をオートクレーブや電子レンジにかけたり、プロテアーゼで部分消化するみたいな乱暴なことをやらないと染色できないもんもありますもん。 塩酸処理がいやだったらDNase I処理でもいいと思います。塩酸処理はdepurinationによってDNAを断片化して抗原性を良くするためです。DNAの断片化なら酵素でもいいわけです。BrdUを取り込ませた核を抗体で検出するときも、DNAの断片化をする塩酸でするかDNaseでするかのオプションがあります（キットにDNaseが同梱されているものもあります）。

塩酸でメチル化シトシンを賦活化して、タンパクと多重染色 削除/引用 No.3771-1 - 2015/01/22 (木) 18:12:23 - megu 皆様 いつも本当に勉強させて頂いております。 不勉強ゆえ、語彙の適切さに不安がありますが、どうかご容赦下さい。 お忙しいところ畏れ入りますが、どうかご教授頂けますと幸いです。 ★背景：サンプルの塩酸処理 Whole mount の免疫染色に取り組んでおります。 メチル化シトシン（5meC）と複数のタンパク質を多重染色し、共焦点顕微鏡で観察したいと考えております。 5meC を認識する抗体で免疫染色する際に、塩酸（2N HClや4N HCl）でサンプルを処理する方法が知られています。塩酸処理によって クロマチンを変性させ、5meC を unmasked するそうです。 一方で当然（？）、塩酸で処理することによって、染めたいタンパク質が変性してしまい、一次抗体が認識できないのでは？と心配でした。そこで実際に、塩酸処理の有無で比較してみました（2N HCl を使用）。 ところが、条件検討の段階ではありますが、目的のタンパク質の染色像に大きな違いが無いようにも思えました。5meCのシグナルもありましたので、自分としては好ましい結果、と捉えています。ただ、タンパク質シグナルの輝度は弱くなっていました。 なお、いくつかの論文は、連続切片を作成し、5meC やタンパク質を染色しております。つまり、5meC を検出したい切片だけ塩酸処理しているようです。 ★質問 「塩酸処理をしたにも関わらずタンパク質を免疫染色できる」（と自分には思われる）ことは、科学的に受け入れられること（普通なこと）なのでしょうか？ 愚問で大変申し訳ありません。恥ずかしながら浅学の身で、いま試している方法（塩酸処理してからwhole mount で多重染色）が科学的に適切なものかどうか、不安になっております。もしかしたら論文で受理できないくらい非常識な手法かも知れません。 研究室でひとり違うテーマに取り組んでおり、往生しております。皆様方のご意見をどうか宜しくお願い致します。 敬具

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