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(無題) 削除/引用 No.3761-14 - 2015/01/22 (木) 21:11:34 - おお >[Re:11] そうたさんは書きました : > 現在の状況ですが、 > ご教示いただいた通り、ネガコンで検出されないことを確認しました。 > 試薬や水のコンタミを否定し、8つのサンプルで前回の結果と同様の検出がされるか確認したところ、すべてにおいて検出が認められました。 すべてで陽性とかいてますが、昔検出されなかったサンプルではノンスペがふえていて、メルティングポイントからネガティブと判断できる可能性はないでしょうか。 また陽性の中で昔コピー数が多いと判断されたやつだけ比較的再現性が取れているということはありませんか? そう言う場合はやはりプライマーに原因があるのかと。

(無題) 削除/引用 No.3761-13 - 2015/01/22 (木) 19:10:51 - ~ 何が増えているのかを確認するために、 増えないはずなのに増えたバンドをクローニングして、 配列を読んでみてはいかがでしょうか。 （何が増えているか分かりませんので、ダイレクトシークエンスでは読めないかもしれません） 増幅した配列によって、対策が変わってくるはずです。 �@ホストのゲノム配列 　プライマーと増えている配列がどの位似ているかが分かりますので、 　○アニーリング温度を調整する 　○プライマーの再設計 �Aウイルスの配列（陰性サンプルで増幅） 　ウイルスのコンタミと結論付けられますので、 　○コンタミ対策 　○（可能であれば）サンプル取り直し �B他のプライマーで増幅されたPCR産物 　プライマーのコンタミと結論付けられますので、 　○プライマーをストック溶液から再調整 　○プライマーの再発注 　○プライマー抜きでPCRにかけて、 　　増えた試薬やサンプルが汚染されているとして廃棄する

(無題) 削除/引用 No.3761-12 - 2015/01/22 (木) 15:20:23 - seven 検量線はプラスミドを使って作っているとのことなので、ゲノムDNAのような様々な配列をふくむものでは非特異的な増幅が出ているのではないでしょうか？ 詳細は書かれていないようですが感染確認＆定量の系なら感染が確実なポジティブサンプルと感染していないネガティブなサンプルは用意できますか？ ポジティブでの希釈系列＋ネガティブサンプルでも、検量線がひける+ネガティブで立ち上がりが十分に遅いものでないと実際のサンプル定量には向いてないプライマーだと言えます。 特異性の問題ならアニーリング温度を上げれば非特異なものは消えるかもしれませんが他のプライマーセットと同時にPCRにかけている場合は難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.3761-11 - 2015/01/22 (木) 13:42:12 - そうた >おお様 ありがとうございます。 実は、うまくいっているのは検量線作成だけで、 再現性は全く取れていません。 実は前回行っていた時と装置や試薬が変わっており、 様々な条件検討を行い、ようやく検量線が作成できたと喜んでおりましたらすべてのサンプルで陽性が出てしまい頭を抱えていました。 現在の状況ですが、 ご教示いただいた通り、ネガコンで検出されないことを確認しました。 試薬や水のコンタミを否定し、8つのサンプルで前回の結果と同様の検出がされるか確認したところ、すべてにおいて検出が認められました。 ただ定量結果には大きくばらつきがあるため、サンプルに何かコンタミがあるとは考えられません。 現在はプライマーに異なるプライマーがコンタミしている可能性もあると考え、再合成したプライマーの到着を待っています。 何か間違った点があれば是非教えていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.3761-10 - 2015/01/22 (木) 13:25:19 - そうた >"様 とても丁寧な解説をありがとうございます。 原因はまだはっきりしませんが、おかげさまで自分の実験について落ち着いて整理することができました。 試薬と水のコンタミは否定できたので、 同じプライマーを再合成し、条件を振ってみます。 検出されないであろうサンプルゲノムを用いて条件検討を行い、 系を確立したいと思います。 またわからないことがありましたら、どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3761-9 - 2015/01/22 (木) 13:13:19 - おお 出るサンプルはちゃんと再現性よく出るのですか?

一部のNCだけ増えるのであれば、コンタミさせているのは… 削除/引用 No.3761-8 - 2015/01/21 (水) 17:18:16 - ~ �@サンプルや試薬が既にコンタミしている �Aプライマーのデザインが良くない �B操作上、自分でコンタミさせてしまっている の３つの原因が考えられますよね。 >3つのNC(水)のうち2つは増幅していませんでしたが、1つは増幅されていました。 �@、�Aの原因では説明がつきませんので、�Bが原因であることを否定できないでしょう。 もしかしたら、昔、誰かがPCR産物やプラスミドを吸い込んでしまったために、 ピペットマン内部が汚染されているのかもしれません。 その場合は、確率論的にDNAが落ちてきたときにだけPCRで増えますので、 ・フィルター付きチップを使って試験してみる ・違うピペットマンのセットで試験してみる ・十分すぎると言えるくらいピペッティングをしたりピペットマンを叩きながら試験してみる などで、ピペットマンが原因であるかの推定ができるかもしれません。 >あるウイルスにネガティブだと考えていた個体で増幅が見られた これは、�@の原因の根拠ですよね。 プライマーの配列がおかしい話にはなりませんね。 >サンプルのコンタミということですが、毎回安定した結果が得られておりません。 これは、�@を否定するような結果ですね。 特定のチューブで想定とは違うけれども毎回同じ結果が出るというのであれば、 サンプルがコンタミしていると言えるでしょうけれども、 増えないときがあるのですから、サンプル自体が汚染されているとはまだ言えないでしょう。 >プライマーのデザインが悪いのでじょうか。 PCR条件があまりよくなく、たまたま増え始めた場合は増えて、 それがなければ増えないという状態なのかもしれません。 まずは�Bを解決したうえで、同じチューブのサンプルで繰り返し再現性を取って�@を否定して、 最後に検討するのが�Aではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3761-7 - 2015/01/21 (水) 16:14:14 - ~ ↓すいません。削除パスを入れているまえに書き込んでしまったために消せません。

(無題) 削除/引用 No.3761-6 - 2015/01/21 (水) 16:12:15 - ~ 説明不足ですみません。 増幅されないはずのサンプルで増幅が見られ、かつ融解曲線でスタンダードと異なる波形が出ているものに関して『非特異』という判断をしています。 以前同じサンプル(血液のgDNA)で同様の実験を行い、あるウイルスにネガティブだと考えていた個体で増幅が見られたことから、この系になんらかの問題があるのではと悩んでいます。 (何度も同じ実験を繰り返すうちに、ネガコンでも増幅が見られたことから、分注の際にコンタミが起こったのだろうと考えています。) 装置の不具合は確認できませんでした。 サンプルのコンタミということですが、毎回安定した結果が得られておりません。現在用いているサンプルは4年前に抽出したもので、これまで私を含めて5人が実験に用いていますので、コンタミの可能性も十分あるとは思っていましたが、サンプル自体のコンタミではないのでしょうか。 スタンダードできれいな検量線が引けていた場合でも、サンプルにおいて均一に検出できないということは、プライマーのデザインが悪いのでじょうか。

(無題) 削除/引用 No.3761-5 - 2015/01/21 (水) 14:48:17 - そうた 皆様、ご返信ありがとうございます。 >AP様 そのようなことがあるのですか。 全く知らずに実験しておりました。 幸いと言っていいかわかりませんが、渡されたプライマーはinvitrogenでオーダーした100nMの原液でしたが、再度合成してみようかと思います。 ありがとうございます。 >おお様 昨日かけたものに関してですが、3つのNC(水)のうち2つは増幅していませんでしたが、1つは増幅されていました。 メルティングポイントは3つありましたが、1つは目的のものと同じサイズで、泳動で確認するに目的のものと同じサイズであると考えられます。 (バンドがとても薄くてはっきりとは確認できませんでした) >"様 説明不足ですみません。 増幅されないはずのサンプルで増幅が見られ、かつ融解曲線でスタンダードと異なる波形が出ているものに関して『非特異』という判断をしています。 以前同じサンプル(血液のgDNA)で同様の実験を行い、あるウイルスにネガティブだと考えていた個体で増幅が見られたことから、この系になんらかの問題があるのではと悩んでいます。 (何度も同じ実験を繰り返すうちに、ネガコンでも増幅が見られたことから、分注の際にコンタミが起こったのだろうと考えています。) 装置の不具合は確認できませんでした。 サンプルのコンタミということですが、毎回安定した結果が得られておりません。現在用いているサンプルは4年前に抽出したもので、これまで私を含めて5人が実験に用いていますので、コンタミの可能性も十分あるとは思っていましたが、サンプル自体のコンタミではないのでしょうか。 スタンダードできれいな検量線が引けていた場合でも、サンプルにおいて均一に検出できないということは、プライマーのデザインが悪いのでじょうか。

(無題) 削除/引用 No.3761-4 - 2015/01/21 (水) 10:59:42 - ~ >非特異が走ったりします。 これは、非特異にPCR産物が生じているという意味でいいのですか？ それとも、ネガコンなのに目的のPCR産物ができていることを非特異と呼んでいるのでしょうか？ 前者ならば、プライマーの再設計の前に、PCR条件の再検討で非特異増幅が起きないようにできるかもしれません。 また、非特異に増幅したものが電気泳動でバンドになる場合、それをクローニングして配列を確認すると、どのような配列から非特異に増幅しているかが分かりますので、プライマーの再設計に役に立つかもしれません。 後者ならば、サンプル、試薬、プライマー等のコンタミの可能性が考えられますので、プライマーを新しく作り直すことに意味はあっても、プライマーを再設計してもプライマー以外のコンタミに効果はないでしょう。 また、現時点で確認できているのはどこまででしょうか？ �@サンプルのコンタミの可能性 同じチューブのサンプルで測定を繰り返した場合に、 結果の再現性はあるのでしょうか？ サンプルのコンタミであれば、同じサンプルでは 繰り返し再現性があるでしょうから、コンタミの判定ができるでしょう。 �A装置の不具合 装置の不具合の可能性は否定できますか？ 同じPCR反応液を複数のチューブに分注し、 サーマルサイクラーの色々な位置において走らせて、 同じ結果が出ない場合、温度の不均一があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3761-3 - 2015/01/21 (水) 04:05:44 - おお 実際にその実験で増幅されてきたPCR productのサイズとかmelting pointはどうですか?水やそのサンプルを解かしたbufferなどでは増幅が見られますか?

(無題) 削除/引用 No.3761-2 - 2015/01/20 (火) 21:36:40 - AP プライマーの保存状態は大丈夫なんでしょうか。分解によって3'末端が削れることにとって標的でない配列から伸長が起こる可能性があります。特に希釈されたプライマーは分解しやすかったり、吸着ロスで濃度が低くなりがちです。設計はそのままで新しく合成し直すだけでも効果があるんじゃないですか。

real-time PCRでの定量のばらつきについて 削除/引用 No.3761-1 - 2015/01/20 (火) 20:02:59 - そうた いつも勉強させていただいています。 real-time PCRについて質問があります。 過去に用いていたプライマーを渡され、以前やっていたことの再現実験を行っています。しかしなかなかうまくいきません。 プラスミドを用いての検量線作成はできているのですが、 サンプルの定量では、データに大きくばらつきが出ます。 また、出るはずのないサンプルで増幅が行われていたり、サンプルによっては非特異が走ったりします。 試薬はTOYOBOのThunderbird SYBR Mixです。 サンプルはゲノムDNAを 2.5ng(/uL)用いています。 アニーリングは、60度です。 これはコンタミと考えたほうがよろしいのでしょうか。 検量線はきれいに引けているのですが、サンプルで非特異が走っているということは、プライマーの設計をし直したほうがいいのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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