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(無題) 削除/引用 No.3741-6 - 2015/01/15 (木) 00:54:39 - おお そう言えばPfuなどは反応溶液にアンモニウムイオンがはいってますよね。。。KODもはいってたかも。その辺が影響するかもですね。

(無題) 削除/引用 No.3741-5 - 2015/01/14 (水) 14:14:05 - おお とにかく一度product manualをおよみください。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3741-4 - 2015/01/14 (水) 13:26:16 - lewis ligaseが不要との意見ありがとうございました！ KODの除去についても検討してみます！ 今からまた試してみようと思います！ ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.3741-3 - 2015/01/14 (水) 00:25:39 - おお すでにしてきがありますようにTOPOベクターのキットを使う限りligaseによるligationは必要ないですね。ベクターにあるTopoisomeraseがligaseの代わりに働きますので。なのでligaseのバッファーがあまりよくなくって反応が阻害されている可能性がありますね。 もう一つきになるのはPCR後KODが除けているかです。TaqでAが付加されても共存するKODで削っていたら効率が悪くなる可能性がないかなぁとおもいました。

(無題) 削除/引用 No.3741-2 - 2015/01/13 (火) 22:37:12 - TK-1 invitrogenのTOPO kitにligaseはいりません。試しにTaqで適当なフラグメントを増幅して一緒にトランスフォーメーションしてみてはいかがですか。それでも出なければ、コンピテントセルの問題？

TOPOベクターのライゲーションについて 削除/引用 No.3741-1 - 2015/01/13 (火) 21:17:49 - lewis ライゲーションについて質問です。 KOD plus neo にて増幅した1761bpのPCR産物に、A-attachment mixによりA配列を付加し、Ligation high Ver.2にてpEF6/V5-His TOPOベクターにライゲーションの後、大腸菌にトランスフォーメーションし増幅予定としていました。 しかし何度試しても大腸菌がLB培地にコロニーを形成しません。 恐らくライゲーションかトランスフォーメーションに問題があると思うのですが、KOD使用でTOPOベクターを用いている方自体が少ないのかもしれませんが、何でもかまいませんので何かご助言いただけないでしょうか？ TaqでなくKODを使用しているためA-attachment mixやLigation high Ver.2を使っていますが、むしろ反応を阻害しているようなことはないのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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