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(無題) 削除/引用 No.3710-4 - 2015/01/08 (木) 09:34:18 - おお あ、nestedで非特異のコンタミを減らすというところがききたかったんですか。じゃあニックは関係ないですね。

(無題) 削除/引用 No.3710-3 - 2015/01/08 (木) 04:50:21 - yyy このキットは使ったことはないのですが、常識的な知識で分かりそうなので回答します。 このキットはある遺伝子の極々一部の配列が分かっている時に、その周辺の未知の部分をクローニングしてこよう、というものですよね。 ゲノムDNAの莫大な数の遺伝子の中から、既知の配列を含むものだけを増幅したいわけですから、それ以外のものが増幅してしまったらそれが「非特異」なものになるわけです。 カセットを使って制限酵素処理された断片を挟んでPCRする場合に、カセットの配列はどの断片でも同じなのですから、もしニックが無ければ、両端にカセットを持つ断片全てについてC1プライマーで挟まれる領域が増幅されてしまうわけで、S1プライマーとC1プライマーで増幅されたPCR産物もありますが、その膨大な「非特異」の中に埋もれてしまうわけです。ニックがあればS1プライマーとC1プライマーで挟まれた領域のみが増幅されます。 一方でS1プライマーは目的の遺伝子の目的の配列には結合するでしょうが、別の遺伝子の同じような配列にも結合するかもしれません。そうすると、S1とカセットのC1で挟まれたそのoff-targetの遺伝子の領域も増幅されてしまい、これも「非特異」となるわけです。この種の非特異を減らすために、2回めのPCRとしてS2とC2でnested PCRをするわけです。別の遺伝子がS1のみならずS2とも同じ配列を持つ可能性は極めて低いでしょうから、「非特異」は2回めのPCRでは増幅されない、ということです。

(無題) 削除/引用 No.3710-2 - 2015/01/07 (水) 23:57:22 - おお 非特異というと何かあまり予測がつかないものを想像するのですが、、、 PCRのとき一本鎖になるので、初回のサイクルでC1プライマーはニックの入ったストランドにつきます。ニックが入っているということは一本鎖になったとき、そのカセットの配列だけがテンプレートから分離するのでそこで伸長がとまります。その短いsingle strand DNAはもしかしたら2サイクル目からS1から伸長した一本鎖にあニールして伸長するかもしれません。初回のテンプレートからニックが入っているため外れた短いカセットの一本鎖はずっとそんざいするので、そこから短い一本鎖のDNAは合成され続けますが、量は実際のPCRで増える量から考えて格段に少ないですし、そういう一本鎖のDNAが下流に影響しないなら、考慮する必要はないでしょう。

TaKaRa　LA-PCR 　in vitro Cloning Kitについて 削除/引用 No.3710-1 - 2015/01/07 (水) 22:58:31 - ミリオンバンブー 説明書に書いてあるLA-PCRの原理についてですが、PCRを2回行う、ニックで止まるとなぜ非特異的な増幅が起こらないのか、プライマーS1から合成されたDNAだけがプライマーC1からの合成の鋳型になり、相補鎖の形成が行われるのかがよくわかりません。どなたか教えてください。

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