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(無題) 削除/引用 No.3697-10 - 2015/01/09 (金) 10:28:39 - 年の瀬 組織さん ご返事が遅くなってしまい申し訳ございません。 ご意見ありがとうございます。 仰るように、陽性細胞が門脈域のみに存在することがはっきりとしていれば門脈域の面積当たりの細胞数が最も感度良く差を表せるような気がします。ただ、おそらくそれで正しくはあるのですが、微妙なところもあり、もう少しmodifyが必要な気もします。 皆様にいろいろとご意見をいただいて、試行錯誤しているところですが、 ランダムに門脈域を選んで、門脈域（周囲）1つ当たりの陽性細胞数を数える、という方法でとりあえず試しています（有意差が出るかどうかは分かりませんが、見た印象に似合った数字は出てきそうです）。 時々はチェックをしたいと思いますので、また何かご意見がありましたらよろしくお願いいたします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3697-9 - 2015/01/05 (月) 12:58:27 - 組織 門脈域の面積を測定して、その中の陽性細胞数をカウントしてはどうでしょうか。測定単位はcells/mm2みたいになります。10-20視野（門脈域）くらいとれば、生物学的な差があるのなら、検出できると思います。もちろんその上で、他のメソッドでも調べてみてはいかがでしょうか。 何視野とるかは、標的細胞の数・分布によります。門脈域1視野に1個あるかないかくらいであれば、20-50視野くらい必要かもしれません。逆に1視野に数十個あるような染色であれば、5視野くらいで十分かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3697-8 - 2014/12/30 (火) 12:08:57 - 年の瀬 直輝さん 経験に基づいた御意見、ありがとうございます。 確かに、遺伝子発現量の比較はすぐに裏がとれると思います。 また、FACSも定量だけではなく、次の研究の展開にも有用だと思うので、積極的にtryしたいと思います。 おおさん 重ねていろいろと教えていただき、ありがとうございます。 どのような数値を集めて、得られたデータをどのように解析するのか、ある程度分かったような気がします。 実験の内容はまだ探索段階ですが、どのようなデータの取り方・解析の仕方が、正しい現象を出来れば見逃さずにとらえられるか、試行錯誤したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3697-7 - 2014/12/30 (火) 09:42:01 - おお >私としては、1匹のマウスについて何視野かとったとして、これを平均してこのマウスについて1視野当たりx個の陽性細胞あり、と決定して、 検定してしまうと同じ結果が出てしまうのであまり気にすることではないんだけど、たとえば各個体20視野とるとして、平均しないで、20視野で何個の細胞があるかをカウントしてその数字をそのまま使って、検定するのもありかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3697-6 - 2014/12/30 (火) 03:45:49 - おお >[Re:4] 年の瀬さんは書きました : > > 各視野の平均をとるばあい、0の視野がいくらか出る場合はパラメトリックな方法で検定するのに難があるかもしれませ。ノンパラを使うとすると各群最低20はいる > > 実際の統計学的な差をとる部分についてもお伺いしたいのですが、 > 私としては、1匹のマウスについて何視野かとったとして、これを平均してこのマウスについて1視野当たりx個の陽性細胞あり、と決定して、 ノンパラをつかうとなると一個体から得られる平均は意味がないのでこの解析はなりたたないです。基礎的実験では何かやってその結果ある変化に気がついて、それを数値化して統計的解析を加えたいということもあるので、最初からそのための実験デザインをしてなかったりといろいろあるとおもいます。ノンパラでするなら、ペアーの実験を数回繰り返して(個体間のさが気になるときは1匹ずづではまずいかもしれませんが、そのときは2、3匹づつで各個体の平均をとらずにまとめて解析しないといけないかもしれません)、それぞれで統計解析して毎回同じ結論がでる。ということを示す手はあります。 すでに組織があって解析しようとするなら、ノンパラだと各個体で分布をみて、まとめても支障がないか確認してからというてもあるとおもいます。 どうしても各個体で数字を出したいなら、各個体でなるべく多くの視野をとり、その個体のポジの細胞の数を反映できる数字をえてcontrol群、test群の平均などでパラメトリック(平たくいえばt-test)になるでしょう。 あと一定方向スキャンは門脈にかぎらず、ランダムにエリアをとるのにもいいかとおもいます。顕微鏡からめを離し視野をずらし、それから視野のフォーカスなどをかくにんしてデーターをとるといいかと。まあ視野をみたまま動かしてもいいですけど、視野に何があるかに捕らわれず機械的にずらしていく感覚でやるということになります。

(無題) 削除/引用 No.3697-5 - 2014/12/30 (火) 01:26:36 - 直輝 「免疫染色で陽性となる細胞数が比較的限局しているため、ランダムに1視野をとったのでは、陽性細胞が含まれていないことが多いです。」 経験的には、こういった場合、免疫染色で陽性細胞をカウントして定量するのは難しいですね。ばらつきを平均化するために、10切片以上、100視野以上のレベルでカウントする必要がありそう…。 「細胞の境界が不明瞭な部分もあり、細胞数を正確に数えることについても私も若干の疑念を感じてはいるのですが、不慣れなためかImageJでの陽性細胞の検出もなかなかうまくいかず」 人の目で識別するのがやっとのものを、ImageJやWinRoofでカウントするのは、専門家に依頼しても難しいです。なので、この件については肉眼でカウントするしかないと思われます。 論文では免疫染色の画像が好まれますが、私の意見としては、遺伝子発現量かFACSで裏を取っておくべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3697-4 - 2014/12/29 (月) 20:39:45 - 年の瀬 おおさん 非常に参考になるご意見の数々、ありがとうございます。 弱拡で細胞数を数えるのは難しいかもしれませんが、弱拡でエリアを設定・スポットを特定して数えるという方法、 門脈域の選び方として、選ぶ基準の設定の仕方（一定方向へのスキャン内の門脈域を全て選ぶ、など）、 など、いずれも私としても非常に納得しやすい方法だと感じました。 ご指摘のように、bestな方法は実験データにより変わってくるのだと思いますし、実際、私の系では陽性細胞は門脈域に多いことを考慮して、よいデータの取り方を考えるべきだと思います。 いただいた意見を参考に、自分の中で良いと思うデータの取り方を考えてみたいと思います。 > 各視野の平均をとるばあい、0の視野がいくらか出る場合はパラメトリックな方法で検定するのに難があるかもしれませ。ノンパラを使うとすると各群最低20はいる 実際の統計学的な差をとる部分についてもお伺いしたいのですが、 私としては、1匹のマウスについて何視野かとったとして、これを平均してこのマウスについて1視野当たりx個の陽性細胞あり、と決定して、 これを複数匹行ってxの平均を出して、この平均値を使って群間で統計解析を行うと考えていました。 おおさんのコメントを私なりに解釈すると、わざわざ1匹毎の陽性細胞数を出さずに、同じ群のマウスの鏡検データを一気に寄せ集めて（もちろん各マウス何視野分かは決めた上で）、この生データの集合を各群間でノンパラメトリックに比較する方法だと思ったのですが、こちらの方が良いのでしょうか？ 確かに、データの母数は圧倒的に後者の方が多くはなりますし、前者の解析法では本来はかなりの数のマウスを揃えないといけないのかもしれません。 ventさん ご意見ありがとうございます。 細胞の境界が不明瞭な部分もあり、細胞数を正確に数えることについても私も若干の疑念を感じてはいるのですが、不慣れなためかImageJでの陽性細胞の検出もなかなかうまくいかず、面積での定量もちょっとあきらめていました。 もう少し勉強してみたいと思います。 FACSも出来ればtryしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3697-3 - 2014/12/29 (月) 18:57:15 - vest 面積で揃えたらどうでしょう？ 個人的には、免染は定量に適していないと思っていますので、カウントなんかは難しいとは思います。 （論文なんかでもたまに見かけますけどね） 再実験が可能なのであれば、FACSなんかで測定することをおススメします。

(無題) 削除/引用 No.3697-2 - 2014/12/29 (月) 17:20:07 - おお >[Re:1] 年の瀬さんは書きました : > 大まかには、強拡大でいくつか視野をとり、... > そもそも、免疫染色で陽性となる細胞数が比較的限局しているため、ランダムに1視野をとったのでは、陽性細胞が含まれていないことが多いです。 弱拡でとればいいじゃないですか。それで細胞の数が数えられないなら、エリアを計算して、相対的数とおきかえるか、弱拡でスポットを特定してそれぞれのスポットの数を数えるか。 > また陽性細胞が存在するのは門脈域周囲に多いため、門脈域を選んで解析すれば効率がいいのかもしれませんが、このような「選ぶ」という操作をしていると、どうしても陽性細胞のある部分を選びたくなってきてしまうのが心情で、「ランダム」の定義が自分の中で分からなくなってきています。 門脈域を選ぶというのはコントロールとテストで同じように選ぶなら全く問題のない行為で、選ぶ基準とか方法がしっかりしていれば問題がないはずです。 例えばスライドを一定方向にスキャンしながら、見つけた門脈域はすべてデーターに入れるとか。 それでもどうしても主観が入ってしまうなら、どれがどちらかわからない、あるいはどうなっていればいいデーターといえるのか知らない人にやってもらう(つまりブラインドでデーターをとる)といいです。 > > 自分の中で「ランダム」だと思う方法で、陽性細胞数がある程度含まれるまでひたすらたくさんの視野をとる、もしくはすべての門脈域を選ぶ、しかないのでしょうか？ もしかしたらポジがある門脈/観察した門脈で数字が出るならそれでもいいんじゃないでしょうか。そうしたときの統計解析方法もあるので。くわえてポジ門脈でポジ細胞数を比較するというコンビネーションも取れるかもしれません。 > このような解析を行う場合、皆様はどのように視野を決定し、解析されておられますか？ えっとbestな方法は得られる生のじっけんdata(つまり顕微鏡像)によって違います。それを見て、どんなことが起こっているのか(門脈域に多いというのもこの一つです)見極めてそれを数字にするにはどうしたらいいのか考えるべきなので、実験によってそれぞれbestな方法があるはずです。逆にいうとここでこうしたらいいよと書いてもあなたのデーターではいい方法でないかもしれません。 > また、「視野をとる数は最低何視野とる」、「ランダムな視野のとり方はこのようにしている」、等の皆様の慣例のようなものがあれば教えていただければ、と思います。 上に書いたように、一定方向にスキャンして目的の領域が見つかったらすべて解析するとかいうのもランダムに選ぶ方法としてつかえるとおもいます。最低限何個とるかもやはりデーター次第でしょう。各視野の平均をとるばあい、0の視野がいくらか出る場合はパラメトリックな方法で検定するのに難があるかもしれませ。ノンパラを使うとすると各群最低20はいるといわれてます。顕微鏡で得られた視野のTUNEL ポジなど数えるときは(培養でしたけど)50以上、できれば100としていました。

免疫染色の陽性細胞数のカウント 削除/引用 No.3697-1 - 2014/12/29 (月) 15:59:48 - 年の瀬 いつも勉強させていただいております。 マウス肝組織の凍結切片に対してあるタンパクの免疫染色を行っており、染色の結果陽性となる細胞の数を定量的に比較したいと思っています。 大まかには、強拡大でいくつか視野をとり、1視野当たりに含まれる陽性細胞数をカウントして平均する、という流れでよいとは思うのですが、具体的な方法・作法が分からず困っています。 そもそも、免疫染色で陽性となる細胞数が比較的限局しているため、ランダムに1視野をとったのでは、陽性細胞が含まれていないことが多いです。 また陽性細胞が存在するのは門脈域周囲に多いため、門脈域を選んで解析すれば効率がいいのかもしれませんが、このような「選ぶ」という操作をしていると、どうしても陽性細胞のある部分を選びたくなってきてしまうのが心情で、「ランダム」の定義が自分の中で分からなくなってきています。 自分の中で「ランダム」だと思う方法で、陽性細胞数がある程度含まれるまでひたすらたくさんの視野をとる、もしくはすべての門脈域を選ぶ、しかないのでしょうか？ このような解析を行う場合、皆様はどのように視野を決定し、解析されておられますか？ また、「視野をとる数は最低何視野とる」、「ランダムな視野のとり方はこのようにしている」、等の皆様の慣例のようなものがあれば教えていただければ、と思います。 このような画像解析に関して初心者であるため、初歩的な質問かもしれませんが、よろしくお願いいたします。

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