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(無題) 削除/引用 No.3693-15 - 2014/12/28 (日) 01:52:38 - おお HEK HeLaあたりなら、極端に細胞増殖や生存にネガティブな効果、半減期が短いなどない限りpoolでも全体的にかなり発現したものが取れますけどね。 リポフェクションなどでそう言う細胞ではない場合やはり入るプラスミド量は少なかったりするんでしょうかね。。。そう言う場合は全体的に発現量が落ちるのかもしれません。 そんな細胞相手でウイルスで効率が上がるなら、ウイルス(レトロ、レンチ)でpoolで実験できるのはわかりますね。

(無題) 削除/引用 No.3693-14 - 2014/12/28 (日) 01:19:32 - 独り言 ウイルス感染による安定発現株ならクローニングなしに一票。私もクローニングしない派。クローニングしなくても細胞の８０％は目的遺伝子を発現しているので、全く問題なく実験に使用できるし、クローン差を気にしなくていいから。 トランスフェクションの場合はクローニングして、発現が良い株を選ばないと十分な発現を得られない。両方ともゲノムにランダムに入るという意味では同じなのに、なぜトランスフェクションは薬剤耐性株を得ても発現効率が悪いのか疑問に思う。

(無題) 削除/引用 No.3693-13 - 2014/12/27 (土) 15:20:26 - 中西部ポスドク Kobayashikanji様の仰る通り、長期に培養するとレンチウイルスもしくはプラスミドの挿入によって破壊された領域の影響を無視出来なくなりますので、最初に細胞株を作った時にたくさんストックをつくって定期的に新しくする方がよいとおもいます。

ピッキングは必要とも思います 削除/引用 No.3693-12 - 2014/12/26 (金) 09:39:39 - Kobayashikanji プラスミドでもレンチでもゲノムに外来遺伝子が組み込まれますので、組み込まれた領域に応じたゲノム変化（エクソンが壊れる、イントロン挿入によるスプライシング変化、KOなど）が起こると考えられます。 このため、例えば3−5個のシングルピッキングを行い、遺伝子もしくは蛋白の発現量（DOX誘導なら誘導時の発現量）に偏りがないことを確認、それぞれをN=1として平均すればこの問題は解決できるのではないでしょうか？ ピッキングなしだと、これらの混在したヘテロな集団となり、継代すると増殖しやすいもの・死ににくいもの、など全体の集団のポピュレーションがどんどん変化するのではないでしょうか？（特に安定株をとった後、何かしらの薬剤をかける実験においては。。。）

(無題) 削除/引用 No.3693-11 - 2014/12/26 (金) 00:33:07 - 中西部ポスドク 私はレンチウイルスを使っていますが、プールで実験を行います。プラスミドをトランスフェクションしてstableを取っていた時はシングルクローンを作っていました。 プラスミドの場合は（シングルカットを入れるかによっても違いますが）、基本的にはランダムにどこがかカットされてゲノムに組み込まれるので、耐性遺伝子を持っているけど目的のものは発現していないというものが存在しました。 レンチウイルス等ではここからここまで、といったはっきりとした配列が挿入するので、耐性遺伝子を持つものは遺伝子をほぼ発現すると見なしています。なので、プールで使えるかと。

(無題) 削除/引用 No.3693-10 - 2014/12/25 (木) 19:25:01 - おお Got it

(無題) 削除/引用 No.3693-9 - 2014/12/25 (木) 18:29:17 - == host側の部位ではなく、元のplasmid vector側の部位、です。ややこしくてすみません。

(無題) 削除/引用 No.3693-8 - 2014/12/25 (木) 18:16:24 - mon 最近はウィルスベクターを使って得られた薬剤耐性の100コロニー以上（実際には1000くらい）のPoolを使うことがほとんどです。 昔散々やりましたが、一回くらいのシングルコロニー単離ではヘテロなもの（複数クローン：サザンブロットで確認）もあったり、形態が変わっていたり、増殖速度が異なったりと、親株に似たものを選ぶのに苦労したので、トラウマがあります。 使った細胞が悪かっただけかも。 シングルコロニーを取るのは発現誘導システムを使った場合で、非誘導時で発現レベルが低く、誘導がよくかかるものを選ぶ場合です。 これもバルクで行いたいけど、どなたか良いモノをご存じないでしょうかね。 TetON+tTSかな？

(無題) 削除/引用 No.3693-7 - 2014/12/25 (木) 18:14:41 - おお >[Re:5] ==さんは書きました : > ウイルスでの導入ならば、インテグレートされる部位が定まっているので、こういった問題がないので、わざわざクローニングする必要がありません。 それはきいたことがありませんが、、、AAVが遺伝子治療で注目されたのは、特定のlocusにintegrateされるからで、逆にいうとほかのウイルスはそういうアドバンテージがなかったのでは、、、 あ、それとも決まったメカニズムでintegrationがなされるということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3693-6 - 2014/12/25 (木) 18:02:38 - == もちろん下に挙げたのは、クローニングする・しないの、あくまで理由の一つですので。

(無題) 削除/引用 No.3693-5 - 2014/12/25 (木) 18:00:24 - == コンストラクトにもよりけりですね。 IRES-耐性遺伝子が下流にあると、耐性をもつ細胞は目的遺伝子を発現していることがかなり高い確率で担保されますが、 プロモーターが別であれば、耐性遺伝子だけ発現する細胞もとれてしまいます。 ウイルスでの導入ならば、インテグレートされる部位が定まっているので、こういった問題がないので、わざわざクローニングする必要がありません。 ご自身の使っていたコンストラクトを調べれば、実験の意味がわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.3693-4 - 2014/12/25 (木) 17:14:52 - UnivT おおさん 教えていただきありがとうございます!! >シングルコロニーをピックアップすることである程度発現がそろった細胞群として使えるほか、必要な発現量がある細胞を選ぶことができます。特に遺伝子が増殖にnegativeに働くとか、半減期が短いなどの場合は、bulk(pool)ではおおくのポピュレーションがほとんど発現してないということもありえるので。 なるほど。安定発現細胞作製時のシングルクローン解析はそういった利点があるんですね。 そしてpoolな細胞で解析を進めることが出来そうで、安心しました。 それにしては一昔前のJBCだとかCancer Researchでは安定発現クローンを2つ、enpty vectorのクローンを2つで解析するような論文を多く見た記憶があります。なぜ当時、poolサンプルで行わなかったのかなあと疑問は残りますが・・おおさんがあげられたようなクローン化しないといけないような理由があったのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3693-3 - 2014/12/25 (木) 16:59:44 - おお >理由を考えていたのですが、おそらくlipofectionとは異なりウイルス感染で遺伝子を導入するため >、より多くの細胞のゲノムにインテグレーションされるためクローン間のバイアスが限りなくゼロになるためではないか？と思っています。 さあそれはどうでしょうかねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3693-2 - 2014/12/25 (木) 16:58:03 - おお シングルクローンをとるとクローンそれぞれ性質が違う可能性があり、遺伝子の発現のための性質をみているのか、クローンの性質の違いを見ているのかわからないことがあります。あるいはクローンの性質の違いが、目的の遺伝子発現での違いをみるのを邪魔するケースもあるかもしれません。 特に高発現のものだけとると、もしかしたら細胞のもともとの性質が何か違うため高発現できるようになったものだけをピックアップしていて、目的の性質をうまく捕らえられないかもしれません。 シングルクローンをピックアップした場合、クローン間のもともとの性質の違いを否定するため複数とるとか、工夫を強いられることがあります。 そういういみでbulk(poolとよくいわれる気がしますが)でやる方が、へてろなポピュレーションの平均化された現象が見れるのでそちらを選ぶ人は少なくないと思います。 逆にシングルコロニーをピックアップすることである程度発現がそろった細胞群として使えるほか、必要な発現量がある細胞を選ぶことができます。特に遺伝子が増殖にnegativeに働くとか、半減期が短いなどの場合は、bulk(pool)ではおおくのポピュレーションがほとんど発現してないということもありえるので。

安定発現株作製時にシングルコロニーピッキングは必要か 削除/引用 No.3693-1 - 2014/12/25 (木) 16:19:56 - UnivT D1です。ラボを新たに変わりました。前の研究室と今の研究室で方針が異なり、困惑しているので質問させてください。 前の研究室では皮膚癌細胞に遺伝子導入し、G418で薬剤選択後、シングルアイソレーションを行い、各クローンで目的のタンパク質の発現量をチェックし、もっとも安定的に高発現するクローンを２つ選び実験を行っていました。 今の研究室ではレトロウイルスベクターで遺伝子導入していますが、この際、薬剤選択後にシングルコロニーアイソレーションせず、生き残った細胞をbulkで実験に用いています。クローン化は必要ないと言われました。 理由を考えていたのですが、おそらくlipofectionとは異なりウイルス感染で遺伝子を導入するため 、より多くの細胞のゲノムにインテグレーションされるためクローン間のバイアスが限りなくゼロになるためではないか？と思っています。 ここで質問なのですが、では、皮膚癌細胞をlipofectamine2000で導入後G418で選択する時にも100 mm dishで50-100個ほどのコロニーが出来ますが、この時にもシングルアイソレーションせずbulkでやってもよかったのではないか？と思うようになりました。 それ以外の可能性としてシングルアイソレーションの場合、より高発現のものを選び出せることなどの利点もあるのかなと思いますが、実際のところ通常のlipofectionで導入した細胞で安定発現細胞を作製する際にはみなさんどうされているのかお聞きしたいです。 今後、浮遊細胞にlipofectaminen3000で導入後、安定発現細胞を作りたいです。この場合にはシングルアイソレーションとなると大変時間がかかりそうです。個人的にはbulkで行いたいです。 みなさまのご意見を伺わせてください。

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