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(無題) 削除/引用 No.3690-11 - 2015/01/06 (火) 17:25:03 - みー おおさん ありがとうございます。 いつも勉強になります。 PC12細胞をベクターに導入する実験はあまりうちの研究室ではやったことがなかったのでこの細胞自身についても勉強したいと思います。 丁寧にタグありがとうございます。 研究室で行える確認方法でやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3690-10 - 2015/01/06 (火) 17:22:59 - みー monさん ありがとうございます。 なかなかお礼を言えず申し訳ないです。 先生とも相談しているとやはり活性が高すぎるというのが出てきました。タイムコースを取り直そうと考えています。

(無題) 削除/引用 No.3690-9 - 2014/12/25 (木) 17:58:31 - mon おおさんのコメントを見て、思い出しました。 ある種の癌細胞（腎がんが多いかな？）は、恒常的に（ある程度）NFkBが活性化されています。これにより、TNFなどのアポトーシスシグナルに耐性になっています。 なお、恒常的な活性化の程度は、正常細胞が外来刺激で誘導されるレベルより低いです。 もしかしてPC12もそういった細胞かも。

(無題) 削除/引用 No.3690-8 - 2014/12/25 (木) 16:40:13 - おお 実際にその細胞がLPSによってNFkBの活性化が起こっているのかなど気になることがいくらかあります。データーが生理的状態を反映しているとしたら、NFkBは刺激せずにも活性化されていて、LPSでさらなる活性化がみられないともいえますが、その前にその細胞自体にほかの問題がある可能性も否定できません。 plasmidのintegrationの位置があまりよくない細胞が多く存在して、NFkB関係なしにすでに活性化しているとか、、、 できればNFkBの活性化状態をほかの方法などで確かめられたら、どこに問題があるか突き止めやすくなると思います。いかにそういう質問がされているBBSみたいなものを張っておきます。リン酸かフォームのWBとか、核移行とかEMSAとかtargetのRNAのqPCRとか、まあ誰でも思いつきそうなものですが、プラクティカルにどれが白黒をつけやすいかはやったことがないので何ともいえません。 ttp://www.researchgate.net/post/What_methods_can_be_used_to_detect_NF-kB_activation LPS刺激あり、なしで比較できるなら刺激なしはnegative controlといえるでしょうから、enhancer lessのものは必要とはいえないかもしれません。ただ実験でどんな事をいいたいかなどもありますので、ご自身の目的に合うかどうか一度お考えください。 LPS刺激の実験の時培地はG418を含んでいますか?含めていればなしでやってみてもいいかもです。実験用に細胞をまくときにG418 freeに変えればいいです。余計な刺激を減らすために。ただ改善するかよくわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3690-7 - 2014/12/25 (木) 15:26:24 - mon 分泌型ルシフェラーゼは使ったことが無いので、以下の文は推測に過ぎないことをご承知ください。 LPS刺激なしで、CMV=4, NFkB=1では、NFkBの値が高すぎると思います。 通常CMV：NFkB=50~1000:1になると思います。 enhancerなし＝Negative controlが目安になりますが、時間がかかりますね。 もっともCMV promoterは特別な選択をかけない限り（例えばIRES-薬剤耐性遺伝子のような構成にする）継代中に弱くなっていくので、具体的な数値がわからないと何ともいえませんが。 少なくとも非誘導であれば、30秒ほどの累積測定でNFkBの実データ（カウント)は3桁以内が望ましいです。

(無題) 削除/引用 No.3690-6 - 2014/12/25 (木) 14:05:32 - みー おおさん 丁寧な回答ありがとうございます。 コントロールベクターなのですがこちらのベクターを使用しています。 www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId... ただ見たところベクターの大きさが少し違うだけで入っているものは同じでした。 CMVがはいっているとかなり発現量が強いのでしょうか？ enhancer lessのベクター導入細胞も作った方がいいのでしょうか？ 今考えているのは 研究室が脳神経系分野なのでNGFを添加して神経様細胞に分化させNF-κBの内在的な活性を抑えてから実験した方がいいのではとも考えています。 分泌型ルシフェラーゼを用いているのですが培地からとっています。 指摘されたように蓄積されているかもしれないと私も考えたので刺激する前に30分washしてから培地を新しいものに変更して刺激しています。 タイムコースも取ったのですがこの時間が差がまだでるという結果になりました。 LPSの濃度を上げた方がいいのでしょうか？ いろいろいって申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.3690-5 - 2014/12/25 (木) 01:03:36 - おお >刺激するときにLPSの入った培地で培地交換をして、同時にLPSの入ってない培地で培地交換をしたものを... これは安定導入株でもやってみる価値があるでしょう

(無題) 削除/引用 No.3690-4 - 2014/12/25 (木) 01:00:35 - おお 安定導入だとintegrationされた場所、コピー数などそろえるのが難しくなるかもしれません。transient expressionで実験できませんか。その場合導入効率補正用のベクターが必要になるでしょうけど。 それとコントロールベクターはttp://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/luciferase_vectors/pMetLuc2-Control/ これですか? CMVが入ってますので相当強いとおもいますが、enhancer lessをネガティブコントロールとしておく方がいいかと思います。CMVと比較して1/5なら、活性はまあまああるなという感触です。 分泌するLucを使っているようですが、刺激をするときにすでに培地にLucの蓄積はないでしょうか。最初から高い下駄をはいてないかなとおもいました。分泌するものは使ったことがないので想像で書いてます。刺激するときにLPSの入った培地で培地交換をして、同時にLPSの入ってない培地で培地交換をしたものをネガティブコントロールにすれば、もう少しわかりやすい結果になるかもしれません。それで一度time courseをとるといいかもしれません。直接的な効果であれば2、3時間で上がってくるでしょうし、見やすいタイミングを見つけることもした方がいいかもしれません。そうするとお使いのコントロールベクターを使う必要がないんじゃないかなと。 Lucの活性はどこからとってますか?培地からですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.3690-3 - 2014/12/24 (水) 23:13:29 - みー monさん 1．そうです。clontech の pNFκB-MetLuc2-Reporter Vector を使用しています。 2．コントロールベクターも同様に clontech の pMeLuc2-Control Vector を使用しています。 3．安定に導入したものです。導入してG418で一カ月セレクションをしたものを使用しています。 4．導入効率は補正していません。やはりした方がよいのでしょうか？ 5．LPS濃度は 10µg/ml で行っています。 　NF-κBベクター導入細胞では 　LPS刺激なしを１としたときLPS刺激ありで1.1 　コントロールベクター導入細胞では 　LPS刺激なしで4、LPS刺激有で5.5くらいです。 　24well plate にまいて次の日にLPS刺激を8時間行っています。 勉強不足がありますがお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3690-2 - 2014/12/24 (水) 21:32:59 - mon いろいろ情報が不正確ですので、みーさんに質問します。 (1)NF-κBベクターとは、NFkB応答配列を有するルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターのことですか。 (2)コントロールベクターとはどのような構成(プロモーター配列）ですか。既製品なら名前でも良いです。 (3)一過性に導入してアッセイを行っていますか。安定導入細胞を使ったアッセイですか。 (4)一過性導入の場合デュアルルシフェラーゼアッセイ等で、導入効率を補正していますか。 (4)どのような時系列で操作していますか。 (5)ルシフェラーゼアッセイなので蛍光強度は誤りで発光量ですが、「高い」「低い」は具体的でないので、説明してください。 例えば、遺伝子導入していない細胞の発光量を１とした場合、LPS刺激していないコントロールベクターは、どれくらいですか？LPS刺激した場合は、....等々。

ベークター導入細胞について 削除/引用 No.3690-1 - 2014/12/24 (水) 19:04:49 - みー 今実験で困っているので助けてほしいです。 今、ベークター導入細胞を用いた実験を行っています。 コントロールベクターとNF-κBベクターを用いています。 それぞれ導入した細胞にLPS刺激を行いNF-κB活性を見ているのですが通常NF-κBベクター導入細胞の方がLPS刺激をした時に活性が上がるはずなのですが上がりません。 しかも、コントロールベクター導入細胞群のみが有意差が付くほど活性があがってしまいます。 蛍光強度で見ているのですが値がNF-κBよりもコントロールベクターの方がなぜか高く出てしまいます。 コントロールベクター導入細胞はどういう定義で扱うのがいいのでしょうか？ また何か方法があればお願いします。 ちなみに 細胞はPC12細胞を用いています。LPSも培地に添加してルシフェラーゼアッセイで活性を見ています。

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