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(無題) 削除/引用 No.3685-9 - 2014/12/21 (日) 20:47:39 - miyu ありがとうございます。 そうですね、今回はこの個人差をどう補うかを実験によって示すことが目的ですので先程の回答を基に考えてみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3685-8 - 2014/12/21 (日) 18:27:09 - おお プラスミドがうまく取れなかった人に合わす必要はないと思います。そういう収量のサンプルは除外するでいいのでははいでしょうか。 あなたが何か実験するとき、複数のサンプルで一つだけ明らかに失敗していた場合、そのサンプルをデーターとして含めますか? (たしかに失敗かどうかの判断をしっかりしないと自分の気にくわないデーターを捨てていることになるので注意はひつようですけど、今回はその話ではないので)。 あるいは収量が低くく、濃度が薄すぎるひとは、濃縮というてはありますethanol precipitationで一度調べてみてください(そのほかにも可能な方法はありますけど)。 でもかんがえてみると、実習で問題点の解決方法をきかれているので、単純にあらかじめ濃度を測るという重要性を考察して欲しいのではというきもします。ただ考えたことはすべて考察としてまとめておくことはいいことだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3685-7 - 2014/12/21 (日) 17:52:11 - miyu 詳しくありがとうございます。 読ませて頂きましたが、おおよそは理解できました。 仮に分光器を使えるとして、気になる点があります。 今回は「各自で光に明暗があるのは操作による個人差でこうなった。だから事前にプラスミド量を合わせるにはどうする？」 という事でしたが、この場合確かに濃度が高すぎる人が、濃度が薄い人に合わせるために希釈するというのは分かります。 それでは普通の光の人が数人いて、個人差により抽出量が少ない人が多すぎる場合はどのようにすればいいのでしょうか？ その抽出量が少ない人に合わせるというのは、ある意味では全員が実験のミスに合わせるという考え方になってしまいます。 分光器で測って、濃度の少ない人が普通の人に合わせるためにはDNAを足してその都度分光器で測って…というのが「DNA量を合わせる」場合に行う操作と考えても変では無いでしょうか？ 今回は実際に行うワケではなく、「今回このように光に差が出たのはプラスミドの抽出による個人差があったため」という仮定があり「では泳動前に事前にプラスミド量を（プラスミド溶液を）等しくするにはどのような事を行えばいいか？」を考察してこいとの事です。 何回もすみません。

(無題) 削除/引用 No.3685-6 - 2014/12/21 (日) 17:27:37 - おお 分光高度計があればDNA量が測れますよね。濃度が考えている濃度の1.5倍あれば1.5倍希釈すればいいわけですし、何ら難しいことはありませんよ。 分光高度計がなければどうしたらいいかということなら、ちょっと考えてください。電気えいどうして光具合で量が違うっていってるんですよね。じゃあ光具合が一緒になる量でながせばいいじゃないですか。 ラフなやり方として、サランラップをUV-transilluminatorの上にひいて、0.5μg/mLぐらいのエチブロを2ulとサンプル2ulまぜてラップの上において、写真をとればいいです。全員のサンプルで 1.2倍とか2倍の希釈系列をつくってスポッとすれば同じ光ぐらいのそれぞれの希釈倍率をみつけることができます。 http://www.researchgate.net/post/Is_there_any_simple-to-use_and_cheap_method_for_a_rough_enough_genomic_DNA_quantification 上記のURLでRobert H. Eiblというひとが、そのイメージをはってますね。 分光高度計があればDNA量が測れますよね。濃度が考えている濃度の1.5倍あれば1.5倍希釈すればいいわけですし、何ら難しいことはありませんよ。 分光高度計がなければどうしたらいいかということなら、ちょっと考えてください。電気えいどうして光具合で量が違うっていってるんですよね。じゃあ光具合が一緒になる量でながせばいいじゃないですか。 非常にラフなやり方として、サランラップをUV-transilluminatorの上にひいて、0.5μg/mLぐらいのエチブロを2ulとサンプル2ulまぜてラップの上において、写真をとればいいです。全員のサンプルで 1.4倍とか2倍の希釈系列をつくってスポッとすれば同じ光ぐらいのそれぞれの希釈倍率をみつけることができます。 またもうすでに一度流しているのだから、その光具合で濃度を決めることができます。でもそのためにはあらかじめ量がわかったDNAが同時にながれてなければいけません。きっと同時に流しているはずです。マーカーです。マーカーとくらべればサンプルのDNAの量がわかるはず。これ以上細かい操作はかきませんのでご自身で考えてください。 それでも、違うゲルでながすとやはり光具合を一しょにするのはむずかしいかもしれません。どういう風に染めているかなど情報がないのもありますので、そこははぶきます。

(無題) 削除/引用 No.3685-5 - 2014/12/21 (日) 16:57:48 - mon 先ほどの文の意味は、もし制限酵素が働かないほど不純物の多いサンプルがあった場合、全部混ぜると、もしかすると（大抵？）混ぜた全員分のサンプルでも制限酵素が働かない可能性があること＝悪貨は良貨を駆逐する、ということです。 混ぜないで各サンプルの濃度を均等にするには、「薄める」か「濃くする」しかないですよね。 「濃くする」方法は、体験済みだと思うよ。

(無題) 削除/引用 No.3685-4 - 2014/12/21 (日) 16:37:11 - mon 均等にするだけなら、混ぜて、人数分に分ければ？ ただし、質もそれなりに落ちますが。

(無題) 削除/引用 No.3685-3 - 2014/12/21 (日) 16:29:21 - miyu ＞＞量をどうしたらはかれるかわかりますよね。あと量が一緒でも違うゲルで流したりすると、検出感度が違ったりする可能性がありますよね。 実は今回が初めての実験で（まだ1回生です）、量を測る方法すら知りませんが、分光器？にあてるとDNA濃度が分かるというのは知識として知っていますが、今回の実験で、プラスミド溶液を作った後にその分光器で測るという事が行えるのか、おこなって濃度が違ってもどう量を合わせるのか分からない状態です。 どのような過程を踏めばそろえられるのでしょうか。 ＞＞写真(image)も露光時間とかとかでいろいろな明るさのバンドが取れますよね。 一応今回は同じ機械で同じ時間で行ったもとで「あまりに暗すぎる人とかもいますが、みんながちゃんと同量で綺麗に見えるためにプラスミド量をそろえるにはどうすべきか？」という感じです ＞＞最終的に具体的にどんなアウトプットを考えているのでしょうか? 今回は電気泳動する際、それまでの過程での個人差による濃度差をどう補うか？（どうプラスミド量をそろえるか）が目的といった感じです。

(無題) 削除/引用 No.3685-2 - 2014/12/21 (日) 15:42:25 - おお 量をどうしたらはかれるかわかりますよね。あと量が一緒でも違うゲルで流したりすると、検出感度が違ったりする可能性がありますよね。写真(image)も露光時間とかとかでいろいろな明るさのバンドが取れますよね。 最終的に具体的にどんなアウトプットを考えているのでしょうか?

プラスミドDNAをメンバー全員でそろえたい 削除/引用 No.3685-1 - 2014/12/21 (日) 14:58:27 - miyu 典型的な学生実験です。 プラスミドをアルカリ法で抽出して制限酵素処理をしたのですが、メンバーによって明るさに差がありました。 制限酵素で処理する前にみんなのサンプルにあるプラスミドの量を等しくするにはどうすればいいか考えてこいと言われたのですが、分かりません。 どういう手順で何をすればいいのでしょうか？ 恐らく正確に量を一致させるなんて事は無理ですよね？ DNA濃度を測る→ある人の基準に揃うようにDNAを余分に足す？くらいしか思いつきませんが、これも具体的にどんな実験をどう行うか説明できないレベルです。 そろえるにはどうすればよいか？どんな実験をどのように行うか教えていただけないでしょうか？

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