全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3679-11 - 2014/12/22 (月) 08:09:29 - りぽ >[Re:10] けんさんは書きました : > >>No.3679-4 > > りぽさん > 質問をさせてください。 > ”導入試薬と核酸を蛍光ラベルして細胞内への取り込みを評価” > 具体的にはどの会社のどの商品を用いて、導入試薬、プラスミドそれぞれを標識するのでしょうか？ plasmid labelingやplasmid trackingなどで検索すれば、論文やキットの情報はかなり集まります。 ざっと見た感じでは、コマーシャルなキットは1つのようです。 取り込み効率をみたい場合はたいてい導入試薬の研究をしていることが多いので、自分たちで作製した導入試薬に蛍光ラベルをするように思います。ですので、蛍光色素を試薬に結合させたものを作る事は難しいことではないように思います。 もし、市販の導入試薬を蛍光ラベルしたいということであれば、難しいかもしれません。 > また蛍光色素がつくことによって、細胞内への取り込み効率は、未標識のときよりも低下（あるいは増加）しないのでしょうか？ これは重要な課題だと思います。未標識の場合との厳密な比較は難しいと思いますし、影響があってもおかしくないと思います。 それでも、ラベルの有無で発現量に差があるか、また細胞内のプラスミドの量を定量的に（qPCRやNorthern、FISHなどでできるかも？）評価する事で、ラベルによる影響をある程度確認する事はできるでしょう。同じ条件なのに顕著に差が出るようであれば、ラベルによる影響が大きいということは言えますよね。逆に、有為な差がみられなければ、ラベルしたものを用いた評価でもそれほど問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3679-10 - 2014/12/21 (日) 09:21:36 - けん >>No.3679-4 りぽさん 質問をさせてください。 ”導入試薬と核酸を蛍光ラベルして細胞内への取り込みを評価” 具体的にはどの会社のどの商品を用いて、導入試薬、プラスミドそれぞれを標識するのでしょうか？ また蛍光色素がつくことによって、細胞内への取り込み効率は、未標識のときよりも低下（あるいは増加）しないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3679-9 - 2014/12/19 (金) 11:11:20 - おお 試薬の濃度とか調べて考えればすぐ解決したはずなのに、、、

ありがとうございました。 削除/引用 No.3679-8 - 2014/12/19 (金) 08:58:00 - ミセル 独り言様： ありがとうございました。 私が知りたかったのはまさにそのことです。助かりました。 これで解決とさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3679-7 - 2014/12/19 (金) 08:54:05 - 独り言 いまいち、質問者さんが何を知りたいのか不明ですが、 例えば、1ugもプラスミドなら大雑把に1pmolある訳で、そこにlipofection複合体を形成させたとして、勝手な想像ですが、１０分子のプラスミドが１個のlipofection複合体を形成すれば、0.1pmol=1x10^12個あるわけですよね。細胞数が1x10^6個なのであれば、その1000000倍の数のlipofection複合体があるわけになるので、細胞が触れる確率はそうとうなものですよ。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.3679-6 - 2014/12/19 (金) 08:24:03 - ミセル 皆様、ご回答ありがとうございます。 774R様とりぽ様のご回答にありますように、細胞との接触後の効率の違いというのは理解できました。また、おお様の教えていただきましたリンクは勉強になりました。 皆様のご助言で私の疑問も絞られてきました。つまり、リポフェクション法では、培地に添加後、すべての細胞とcationic-lipid complexが遭遇するのでしょうか？ということです。 やはり、細胞数に対して複合体の量が過剰なものですか？もしそうなら確率的にコンタクトしない細胞は無視してもいいぐらいなのかな？と思いました。

(無題) 削除/引用 No.3679-5 - 2014/12/19 (金) 08:02:30 - りぽ 書き忘れましたが、細胞への取込量とプラスミドからの発現量、もしくはsiRNAによるノックダウンの効率は必ずしも一致しません。これは、取り込まれてからエンドソームからの放出効率、核への移行する効率が異なるからです。 「導入効率」をどのような意味で用いているかで質問の意図が変わります。

(無題) 削除/引用 No.3679-4 - 2014/12/19 (金) 07:58:59 - りぽ よく行われる手法として、導入試薬と核酸を蛍光ラベルして細胞内への取り込みを評価します。 その際、共焦点顕微鏡で細胞内に取り込まれていることと、エンドソームのマーカーとの共局在を確認します。 一般的には細胞内への取り込みは比較的効率はよくて、エンドソームから如何にして放出できるかが重要だと言われています。 ちなみに、作用が異なるのでsiRNAとプラスミドを比較するのは無理があります。

(無題) 削除/引用 No.3679-3 - 2014/12/19 (金) 07:17:29 - おお >[Re:1] ミセルさんは書きました : > また、導入効率３０％とかいうのは、３０％の細胞しか接触できませんでした、と同義なのでしょうか？ ちがうでしょう。同じlipofectamineの量でDNA量をふって効率のいい ratioをさぐったりするわけで。同じ量のlipofectamineで接触の機会が変わるというのは考えにくいし。 > > siRNAの方が多くの細胞に導入されているよう気がしており、単純ではない気がしております。 分子の数として多くなるのは単に1ugでもプラスミドより分子の数が相当多いというのもあるでしょうけど、まず多いというのをもう少し科学的にどう言うことか冷静にみる必要がありませんか? > > この辺のことを少し科学的に理解したいのですが、論文の絞り込みがtransfectionではあまりにもアバウトで、、、 lipofectionでタイトル、アブストラクトから検索したらどうでしょうか。lipofectionのメカニズムや方法論的検討をしているなら、そう言う用語がtitleやabstractに入っているでしょうし、単になんかをtransfectionしたぐらいなら、abstractにはそんな用語をいれないでしょうから。 ttp://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/cs/b813869a

(無題) 削除/引用 No.3679-2 - 2014/12/18 (木) 21:08:34 - 774R 接触、エンドサイトーシス、核内移行、転写、翻訳 という多くの過程があるのだから、接触だけで「見かけの」トランスフェクション効率が決まるわけではないのは理解できると思います。

遺伝子導入の確率 削除/引用 No.3679-1 - 2014/12/18 (木) 20:55:56 - ミセル 皆様、はじめまして。今まで、トランスフェクションをマニュアルに沿って何も考えずにやっていたのですが、実験を進める上で考える必要が出てきたため質問します。 よくあるlipofection法でsiRNAやplasmidを遺伝子導入する場合、例えば1x10^6個の細胞に対してlipofection複合体を培地中に添加した場合、その複合体は一定時間後に全ての細胞とコンタクト出来るのでしょうか？また、導入効率３０％とかいうのは、３０％の細胞しか接触できませんでした、と同義なのでしょうか？ 遺伝子導入は添加後、一定の確率で細胞と接触したものが細胞に入る、と以前聞いたことがあるのですが、経験的に同じ細胞でもDNAより、siRNAの方が多くの細胞に導入されているよう気がしており、単純ではない気がしております。 この辺のことを少し科学的に理解したいのですが、論文の絞り込みがtransfectionではあまりにもアバウトで、、、 もしもご存知の方がおられましたら、教えていただきたく、宜しくお願いいたします。 （文献ありましたら、教えていただければ幸いです。）

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---