全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3663-18 - 2015/01/20 (火) 21:22:57 - AP ExTaqPCR産物はAの一塩基突出の物と平滑の物の混合物になると能書きにうたわれています。前者(あるいは逆だったか)が1/3くらい含まれるのでTAクローニングも可能だと。国内向けの情報でははっきり述べられていないようですが、海外向けのをみると、Taqに校正活性のある酵素をミックスしたもののようです。 それはそれとして、A突出端を作るTaqでもjoining PCRは可能だと思います。 オーバーラップする2つのPCR断片が全て突出を持っていたとして、これらを混合し最終産物の両端のプライマーでPCRをかけたとします。おそらくはじめのうちは、投入した断片が、もう一方の断片を鋳型として伸長する反応はほとんど起こらず、 それぞれのプライマーから、一本鎖のDNAばかりができます。伸長反応は100%鋳型の端っこまで伸びきるわけではなく、伸びきらない、従って鋳型非依存的なAの突出のないものもできます。こういう一本鎖同士がオーバーラップから伸長すれば、指数関数的にPCRがかかる鋳型になります。

スプライシングバリアントによるアイソマーが存在するPCR 削除/引用 No.3663-17 - 2015/01/20 (火) 19:28:56 - 誠 使っているポリメラーゼは、Ex Taqです。3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が関係していそうでしたら考察していただけると幸いです。 (Aが付加されていても除去してくれるのかなぁ…と。)

(無題) 削除/引用 No.3663-16 - 2015/01/20 (火) 19:22:05 - 誠 mon様 >付加の効率は100%でないことと、末端の塩基によって、付加効率が異なりまた付加される塩基はAとは限らないので、個別のクローニングだと何とか成功します。 確率的な話になりますが、ligation PCR後の泳動で単一のバンドが検出されていれば、成功していると考えてよろしいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3663-15 - 2015/01/20 (火) 14:20:42 - AP >Molecular Cloningには、PCRの際にTaqを使うと書いてあり、実際にTaqを使って実験を進めました。 手引書に書いてあるのは料理のレシピのようなですから。まあ、始めてやることなら教科書通りにやるというのも大事かもしれませんが、それを手本、たたき台にして自分の系にあったように変更が加えられて然るべきものです。酵素の変更もそのひとつでしょう。 Molecular Cloningは単なるプロトコール集ではなく、背景となる原理や考慮するべきパラメータなどの論議がしっかりしています。どこをどういじれば自分の系にフィットできるかとか、どこをいじっていはいけないかなんかを考える手助けになります。

(無題) 削除/引用 No.3663-14 - 2015/01/19 (月) 23:45:56 - おお >[Re:11] 誠さんは書きました : > こんばんは。 > Overlap Extension PCRを行なったところ、目的バンド付近に単一のバンドが見られたのですが、ここで1つ疑問があります。 > Molecular Cloningには、PCRの際にTaqを使うと書いてあり、実際にTaqを使って実験を進めました。しかし、Taqを使うと３’末端にAが付加されますよね？この付加されたAはLigation PCRの際に何かの邪魔にはならないのでしょうか？ 私は念のためT4 polymeraseで平滑末端にします。かなりligationしにくいときがあります。付加された塩基がそのままinsertされたりというのもまれにありましたし。

(無題) 削除/引用 No.3663-13 - 2015/01/19 (月) 21:20:35 - mon >[Re:11] 誠さんは書きました : > Molecular Cloningには、PCRの際にTaqを使うと書いてあり 古い書籍なので、proof-reading Enzymeが入手しにくかったころだからかな？ ＞この付加されたAはLigation PCRの際に何かの邪魔にはならないのでしょうか？ 付加の効率は100%でないことと、末端の塩基によって、付加効率が異なりまた付加される塩基はAとは限らないので、個別のクローニングだと何とか成功します。 しかし経験上、ライブラリーを作製するレベルの実験では問題になりました。

(無題) 削除/引用 No.3663-12 - 2015/01/19 (月) 20:24:00 - 誠 Taqの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性と、ニックトランスレーションが関係してますかね？

TaqによるA付加の影響 削除/引用 No.3663-11 - 2015/01/19 (月) 19:56:02 - 誠 こんばんは。 Overlap Extension PCRを行なったところ、目的バンド付近に単一のバンドが見られたのですが、ここで1つ疑問があります。 Molecular Cloningには、PCRの際にTaqを使うと書いてあり、実際にTaqを使って実験を進めました。しかし、Taqを使うと３’末端にAが付加されますよね？この付加されたAはLigation PCRの際に何かの邪魔にはならないのでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.3663-10 - 2015/01/09 (金) 12:21:39 - 誠 おお様、AP様 molecular cloningがあったので勉強してみます。御指南ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3663-9 - 2015/01/09 (金) 12:11:16 - AP 追伸で、 どうしても別アイソフォーム由来の副産物が出来てしまう場合、nested-PCRで排除できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3663-8 - 2015/01/09 (金) 11:32:31 - おお APさんフォローありがとうございました。 >[Re:6] 誠さんは書きました : > FwかReどちらかのプライマー使って、ポリメラーゼの伸長速度から考えて伸長時間を調節し、産物のサイズをアイソマー特異的な配列になるようなPCRをかける(例えば100bpになるように)。 > 電気泳動によって100bp付近にあることを確認する。 > その産物と、反対側のプライマーを用いてcDNAに対してPCRを行う。 > ということでよろしいでしょうか。 ちがいますね。一方は末端、もう一方はisoformスペシフィックなプライまーで、isoform specificな 二本鎖のDNA fragmentをえるわけです。この二本鎖のDNA fragmentをプライまーのように使うことで、isoform特異的な増幅をします。

(無題) 削除/引用 No.3663-7 - 2015/01/09 (金) 10:37:26 - AP おおさんではないですが、 手法自体は、overlap PCR、joining PCR、overlap extensionなどという名で呼ばれている、ごく一般的なものです。詳しいことは成書で学ばれるのが良いと思います。例えばMolecular Cloningではsite-directed mutagenesisを行う手段の一つとして紹介されています。 一方のプライマーが特異的で、もう一方が複数種の標的で働きうるとき、後者のプライマーから複数種のDNAが合成されたとしても、それだけでは相加的しにしか増幅は起こりません。そのうち、反対側の特異的プライマーが働きうるものだけが指数関数的に増幅するので、実質的に特異的産物だけが取得されます。 5' RACEとか3' RACEという手法があるくらいだから（鋳型末端の共通配列と遺伝子内部の特異的配列でPCRをかける）考えるまでもないでしょう。

スプライシングバリアントによるアイソマーが存在するPCR 削除/引用 No.3663-6 - 2015/01/09 (金) 09:51:05 - 誠 おお様 返信を頂いてから時間が経っていますが、返事を書かせていただきます。 おお様の知り合い様がやっているPCRというのは、僕の解釈ですが、 FwかReどちらかのプライマー使って、ポリメラーゼの伸長速度から考えて伸長時間を調節し、産物のサイズをアイソマー特異的な配列になるようなPCRをかける(例えば100bpになるように)。 電気泳動によって100bp付近にあることを確認する。 その産物と、反対側のプライマーを用いてcDNAに対してPCRを行う。 ということでよろしいでしょうか。 疑問点が幾つかございます。 まず、どちらか一方のプライマーを使ってアイソマー特異的な配列まで伸長する際に、例えばアイソマーが5種類あれば5種類の産物ができてしまうのはないかという点です。 もう一つは、疑問点といいますか、このような特殊(?)なPCRをかける際の注意点等なにかあるかということです。 お忙しいとは思いますがお返事お待ちしております。

(無題) 削除/引用 No.3663-5 - 2014/12/14 (日) 21:27:29 - おお ではmonさんのほうほうでいいかと。 加えて、数百ベースの二本鎖DNAもプライまーとして働くことができるのを利用することもできるかもしれません。実際にこれが好きな人がいてそれを利用してsite direct mutagenesisをする人をしっています。 どちらかの末端からそのアイソフォームスペシフィックな部分までまずPCRで伸ばします。でますはそのPCR productsを得て精製します(精製は必須でないかもしれません)。 えられたPCR productsと反対側のプライマーを混ぜてPCRします。PCR productsのあいそフォーム特異的な配列から伸長するので目的のものが取れるといったぐあいです。この時pfuなどproofreading活性がある酵素は使えないと思います。 二か所でスプライシングバリアントができて合計4つとかコンビネーションがあったりするなら、まず末端を選んでそこから近い方のスプライシング特異的配列までPCRして、そのPCR productsをプライまーにして更に次の特異的なところまでPCRしてと段階的に伸ばすことも可能です。 Taqとかをつかうので複数回のPCRをかましたりするため、エラーが入りやすいというのが難点です。

(無題) 削除/引用 No.3663-4 - 2014/12/14 (日) 19:48:22 - 誠 クローニング用に、ORFの全長が欲しいです。

(無題) 削除/引用 No.3663-3 - 2014/12/14 (日) 15:42:26 - hh クローニングしたいのか定量したいのかで変わってきますが

(無題) 削除/引用 No.3663-2 - 2014/12/14 (日) 15:04:18 - mon PCRを2つの領域に分けて行い、PCR産物を2回目のPCRで連結すればよいのでは。 今回の3'側のPCR産物ははoligoだけで合成できそうですが。

スプライシングバリアントによるアイソマーが存在するPCR 削除/引用 No.3663-1 - 2014/12/14 (日) 14:12:13 - 誠 いつも質問ばかりすみません。 現在PCRで増やそうとしているORFなのですが、プライマーのフォワードとリバースの配列と完全もしくはほぼ一致している配列を持つアイソマーが7つ存在しており、特異的に、狙っているORFを増やすことができていません。 スプライシングバリアントによるアイソマーなのですが、プライマーを数十merまで長くしないと、欲しい配列の固有な配列まで届かず、どうしてもアイソマーが出てきてしまいます。 何かいい方法はありませんでしょうか？ (伝わりにくい文ですみません。)

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---