初めまして。
ほ乳細胞へのエレクトロポレーションに関して、御教授頂きたいことがあります。
血球系細胞へエレクトロポレーションを行い、遺伝子を導入しようとしています。
詳しい手順を下記致しますので、何かおかしな箇所があればご指摘頂きたく投稿させていただきます。
pEGFP-N1 (4.7 kb, 2 mg/ml) 15 ugを200 ulのbufferに懸濁させた2 x 10E6個の細胞の入ったキュベットに入れ、パルスを与えています。約80%の細胞がGFP陽性になります。
ただ、目的のプラスミド(10 kbと9 kb, 0.5 mg/ml) を同様に15 ug分入れますと、全く目的のタンパク質が発現していません。このプラスミドはHEK293TやCHO細胞に発現するとC末に付いたタグ抗体により綺麗に検出できます。
そこで原因を調べている最中、下記のサイトを見つけました。
ttp://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/electroporation.pdf
これはES細胞へのエレクトロポレーションのようですが、驚いた事に、以下2点が私のプロトコルと大きく異なっていました。
1. プラスミドを制限酵素でリニアライズしておく。
2. 5Kbp→10~25μg
10Kbp→50μg(これが基本)
というようにプラスミドの量をサイズが大きくなる場合には増やしているようです。
一度50 ugで行ってみる予定ですが、リニアライズをしたり、量を増やしたりするのはエレクトロポレーションに限った話でしょうか？やはり線状の方がいいでしょうか？また、オススメの制限酵素処理というものは存在しますか？平滑末端になるだとか、突出末端になるような酵素がいい、などtipsがありましたら合わせて教えていただけませんでしょうか？ |
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