Bio Technical フォーラム

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No.3649-7 - 2014/12/11 (木) 10:51:44 - AP
基本です。教科書見るなりメーカーのキットの能書き見るなりしたらよかろう。

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No.3649-6 - 2014/12/11 (木) 10:50:19 - Hpa1
AP様

Pfuで増やしたPCRプロダクトをそのままHpa1サイトに入れたかったのですが、他の酵素（BglII, Xho1, EcoR1）で切った後にブラントエンドすることもできるのですか？

その方法を教えていただけないでしょうか？
切って貼ったというような経験しかないために想像がつきません。
お手数ですが教えてください。

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No.3649-5 - 2014/12/11 (木) 10:41:27 - AP
>Hpa1サイトしかクローニングできないインサートですのでとても困っています。。

Hpa1はblunt-endですけど。
insertがblunt-endならHpa1断端である必要はないし、クローニングサイトの他の酵素で切れるならbluntingするというてもありますが？変なところで引っかかっているよりそのほうがいいのでは？

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No.3649-4 - 2014/12/11 (木) 10:33:00 - Hpa1
774様、AP様

シークエンスはしていませんが、コマーシャルなベクターでいくつかの論文ではHpa1サイトに目的のインサートをライゲーションしていますのでシークエンスは存在していると思います・・

前にコマーシャルなpcDNA3.1-V5-HisB/LacZの、LacZ内の二つのHpa1サイトを切断しようとしたことがありますが、その際にも切断できませんでした。

シングルカットであれば、一本のみのバンドになるはずだと思うのですが・・

他の酵素での切断はpMSCVpuroでは試してませんが、pcDNA3.1-V5-HisB/LacZはBamH1/Not1でLacZを切り出せた事から、Hpa1が私の系でworkしていないと思います・・

Smartcut bufferに切り替えたりしたら上手く行くのでしょうか・・
今日全く新しいHpa1（Exp: 1/2015）を使ってもダメでしたので、条件が悪いような気がします・・
Hpa1サイトしかクローニングできないインサートですのでとても困っています。。

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No.3649-3 - 2014/12/11 (木) 09:56:51 - AP
他の酵素ではちゃんと切れるのですか？
精製の時にアルカリ変性過剰だと、部分解離してどの制限酵素でも切れなくなることがあります。

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No.3649-2 - 2014/12/11 (木) 09:50:55 - 774
とりあえずの対応としては、
シークエンスして、サイトが存在するか確認する。
他のベクターを切ってみる。
くらいでしょうか？

お助けください。Hpa1で切れません。 削除/引用
No.3649-1 - 2014/12/11 (木) 09:44:15 - Hpa1
お助けください・・

今pMSCVpuroをHpa1でシングルカットしています。
カット前と後とでバンドの出方が同じで濃いbandが二つに、薄めのバンドが一つでます。

このpMSCVpuroはMaxiprepの産物です。

以下が詳細なプロトコルです。
pMSCVpuro: 1 ug (1 ul)
NEB buffer 4: 2 ul
Hpa1: 1 ul
water: 16 ul

2 hrs, 37度です。

確認は1% agarose gel electrophoresisです。
一番下の濃いめのbandのうちのひとつが酵素処理で若干の変化が認められますが、大して差がないです。そこで別のlabから新しいHpa1をいただき、それでもカットしてみましたが同じ結果で3つのbandが見られました。酵素を二倍に増やして、3 hrsカットしてもダメでした。

NEBのバッファーチャートを見るとHpa1はbuffer 4以外、難しい酵素のようです。
皆様の中で同じような経験をお持ちの方、おられませんでしょうか？
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