BioTechnicalフォーラム [お助けください。Hpa1で切れません。]

(無題)

No.3649-26 - 2014/12/12 (金) 10:02:50 - AP

>そもそもpolymerase活性のほうがexonuclease活性より強いはずで、
これは基質（伸長可能な鋳型とプライマー、dNTP)が十分ある場合に限ります。

そうでない場合になにが起こるか、例えばサンガー法のプロトタイプである、T4 polを利用した+/-法なんて手法を見てみるとよくわかるでしょう。

またここで紹介したように、投入するdNTPをコントロールして付着末端を作る反応もできます。
http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1554
No.1554-5

(無題)

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No.3649-25 - 2014/12/12 (金) 09:24:00 - AP

>3'がexo活性で削られた場合はdNTPが産生されるから
？
dNMPですよ。いったんリン酸が外れたヌクレオチドに高エネルギーリン酸結合をつくるためにはエネルギー（ATP)が必要で熱力学的にもありえない。

好熱性polでちゃんと調べた論文があるかどうかは知りませんが、T4 polやKlenowなどではよく知られた現象です。
今の人はあまりやることないでしょうけれど、T4 polやKlenowで末端を放射性ヌクレオチドで標識する方法があります。3'陥没末端をfill-inするときに取り込ませたり、T4 polでは平滑末端のヌクレオチドの交換反応を利用します。
交換反応はまさに
>末端ではbluntの状態で止まっているわけではなく、削り込んで3'陥没になるのとそれを伸長して埋め戻す反応が繰り返されています。
この反応を利用したものです。
また、この標識法は反応時間を長くしすぎると、exo活性が優位になるため比活性が下がってくるので、反応時間のコントロールが必要なんです。
Molecular Cloningには酵素の特性を解説した項があるので、読んでみてください。

今でも、校正活性のあるPCRをしたあと長時間放置すると、blunt-end ligationの効率が下がるということは経験されている人は少なくないと思いますが、exo活性優位になって末端が平滑でなくなってくるからです。

(無題)

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No.3649-24 - 2014/12/12 (金) 09:01:39 - pol

>[Re:16] APさんは書きました :
> 長すぎると逆反応(3' exonuclease活性）が優位になって削れこみを起こして3'陥没末端になってしまい失敗することがあります。
> 校正活性の強いpolymeaseは伸長反応とexo反応の平衡が大事で、伸長反応が抑えられるとexo反応が優位になります。末端ではbluntの状態で止まっているわけではなく、削り込んで3'陥没になるのとそれを伸長して埋め戻す反応が繰り返されています。その状態を長時間続ければ、やがてdNTPが消費されて十分な濃度を満たさなくなります。そうするとexo優位で削れていくだけです。

横から質問ですけど、そもそもpolymerase活性のほうがexonuclease活性より強いはずで、3'がexo活性で削られた場合はdNTPが産生されるからdNTPが枯渇することはなく、すべてのDNA断片が平滑になった状態で平衡状態が保たれると思うのですが。
何か文献や資料があるのでしょうか。
ちなみに、例に出ているBlunting highは2分で十分で30分でも効率は変わらない、と書いてます。

(無題)

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No.3649-22 - 2014/12/12 (金) 00:10:35 - 独り言

> 今pMSCVpuroをHpa1でシングルカットしています。
> カット前と後とでバンドの出方が同じで濃いbandが二つに、薄めのバンドが一つでます。
>

pMSCVpuroってレトロウイルスベクターですよね。普通はシングルの濃いバンドにニックの状態によってマイナーなバンドが近くに見えることはあるけど、2つの濃いバンドはプラスミドが大腸菌内で組換え起こして、変になってしまっているように思えます。

他の酵素でマップ通りにきれるかどうか確認したほうがいいような気がする。

(無題)

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No.3649-21 - 2014/12/11 (木) 23:26:17 - おお

ベクター側を脱リン酸化しないで、insertを過剰に入れればうまくいくこともあるようです。EcoRIで切って、ブラントにしたらセルフライゲーしょんはEcoRIでは切れませんが、別の制限酵素認識配列(AseI XmnIなど)ができているので、それできることでセルフライゲーションプロダクトを除くことができます。XmnIはもしかしたらAmp上にあるかもしれません。ユニークな酵素であるか確認する必要があります。
セルフを制限酵素できってしまえれば、初心者でもかなり簡単になるはず。
ブラントエンドを生じる酵素なら、セルフは同じ酵素で切れますので、もっと楽ですね。EcoRVとかSmaIとかないですかね。。。

(無題)

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No.3649-20 - 2014/12/11 (木) 19:31:47 - AP

>BAP処理したベクターにはligatinできませんが、そのあたりは大丈夫ですか？

ベクターのphosphatase処理はしないでligationして、その後、もとの制限酵素（EcoR1、もしHpa1で進められていたならHpa1)で切って、セルフライゲーションを排除する作戦と見た。

(無題)

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No.3649-19 - 2014/12/11 (木) 17:43:54 - MP

長さにもよるけど、両端bluntのligationはかなり難しいと思う（特に初心者）。
それにこのケースはPCR productを直接ligationしようとしているようですが、primer かPCR産物をリン酸化しない限り、BAP処理したベクターにはligatinできませんが、そのあたりは大丈夫ですか？
PCR産物をキットでクローニングベクターに移してから使うか、primerに制限酵素サイトを付加するのほうが、急がば回れでいいような気がする。

(無題)

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No.3649-16 - 2014/12/11 (木) 13:01:19 - AP

>では、まずvectorをEcoR1で切断後、QIAquick spin columnでEcoR1を除いた後、Pfu bufferとPfu、10 mM dNTPsを加えて、72度、5 min反応を行わせることにします。

それでいいと思います。
ちなみに、bluntingでKlenowやT4 DNA polのほうがいい点は、たいていのバッファーで十分な活性（Molecular Cloningによれば50%以上）を発揮するので、制限酵素消化のあとバッファー交換や精製をせず、直接、酵素とdNTPを加えればいいことです。
Pfuは制限酵素バッファーでは酵素活性がないか非常に低い(20%以下）のでそうはいかないようです（Fermentusの資料による）。

>5 minで十分ですよね？長過ぎる事も良くないのでしょうか・・
時間はそんなものでしょう。ちなみにKODを使ったToyoboのBlunting highという製品では２分です。
長すぎると逆反応(3' exonuclease活性）が優位になって削れこみを起こして3'陥没末端になってしまい失敗することがあります。
校正活性の強いpolymeaseは伸長反応とexo反応の平衡が大事で、伸長反応が抑えられるとexo反応が優位になります。末端ではbluntの状態で止まっているわけではなく、削り込んで3'陥没になるのとそれを伸長して埋め戻す反応が繰り返されています。その状態を長時間続ければ、やがてdNTPが消費されて十分な濃度を満たさなくなります。そうするとexo優位で削れていくだけです。

(無題)

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No.3649-15 - 2014/12/11 (木) 12:05:57 - Hpa1

AP様、おお様

そういうことだったんですね。
DNA T4 polymeraseは37度で伸長が起こるので、Pfuを用いる場合にはより高温（72度など）で行えば良いということなんですね。

では、まずvectorをEcoR1で切断後、QIAquick spin columnでEcoR1を除いた後、Pfu bufferとPfu、10 mM dNTPsを加えて、72度、5 min反応を行わせることにします。

DNA T4 polymeraseのキットでは5 minとありましたので、5 minを考えましたが、5 minで十分ですよね？長過ぎる事も良くないのでしょうか・・

Pfuで反応させた後、インサートを加えてライゲーションさせます。

その後、QIAquick spin columnでligaseを除いた後、再度EcoR1で切断し、transformationに向かうことでいけそうな気がします。

本当にこれまで長くこのような基本を知らずに多くの時間を無駄にしていたと思います。
AP様、おお様には心から感謝申し上げます。

(無題)

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No.3649-14 - 2014/12/11 (木) 11:25:34 - AP

bluntingはT4 pol, Klenowのほか校正活性のある好高温性polでも可能です。
5'突出端の場合は陥没端を伸長して埋めます。
3'突出の場合は突出端を削ります。
exonuclase活性の低いKlenowは、後者の場合にはあまり使われませんが、意図せぬ削りこみによって失敗することが少ないので、前者の目的には推奨されます。
好高温性polでbluntingするというのは、まだそれほどポピュラーでは無いと思いますが、ToyoboがKODを使ったblunting kitを出していたと思うので、反応条件など参考にしたらいいと思います。

(無題)

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No.3649-13 - 2014/12/11 (木) 11:24:38 - おお

>[Re:10] Hpa1さんは書きました :
> >[Re:7] APさんは書きました :

> 例えばPCRに用いたPfuを、ベクターをEcoR1で切断後、精製して、それをPfuで

じっさいPfuなどを使うプロとコールはあります。37度では伸長反応が起こらないので、、、バッファーもPfu用でよろしいかと。

(無題)

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No.3649-12 - 2014/12/11 (木) 11:22:01 - おお

え、maxiprepってそう言う用途なら1000回分ぐらいあるんじゃないの、、、てかそれってストックで昔から使われているやつ?購入したオリジナルチューブから200ngぐらいとっても十分にconstructionできるよね。。。

(無題)

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No.3649-11 - 2014/12/11 (木) 11:09:41 - Hpa1

>[Re:8] おおさんは書きました :
> プラスミドにそこそこの量のアルコールなどのcarry overがあればほかのエンザイムでも効かないかもしれませんので、まあだまされたとおもって、一度えたチンしてみてください。

全てのベクターをカットに使ってしまったので次回エタチンを行う事にしてみます。ありがとうございます。

(無題)

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No.3649-10 - 2014/12/11 (木) 11:07:51 - Hpa1

>[Re:7] APさんは書きました :
> 基本です。教科書見るなりメーカーのキットの能書き見るなりしたらよかろう。

教えて下さいばっかり使ってしまい大変情けなく思います・・周りに聞ける者がおりませんでしたのでここで聞いてしまいました。

Blunt end化というものができるんですね。ということはベクターをBglII, Xho1, EcoR1のいずれかで切断した後、blunt end化を行えば、そこにPfuで増やしたものをクローニングできますね。

ただ、DNA T4ポリメラーゼというものは持っていません。
原理としては、5'->3'ポリメラーゼ活性と、3'->5'ポリメラーゼ活性を持ち合わせるポリメラーゼであれば何でもいいのでしょうか？

例えばPCRに用いたPfuを、ベクターをEcoR1で切断後、精製して、それをPfuでT4 DNA polymeraseの添付文書にならって反応させたらT4 DNA polymeraseと同様、平滑化は起こるのでしょうか？
全く門外漢なので稚拙な質問になっていると思います。経験がありませんので、どうか確認させてください。

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