全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3638-7 - 2014/12/08 (月) 18:16:04 - mon > 抗体医薬とか相当高発現させてますよ。 この場合は抗体遺伝子を徐々に増幅させているため、細胞が大量分泌に適応しているとも考えられます。 CHO細胞の場合、抗体分泌を担うマスト細胞に特徴的な転写因子X-box binding protein(spliced form)を過剰発現させると、ERの体積が増え、IgGの分泌量が最大4-5倍上がるという報告もあります。BMC Biotechnology, 14(1), 26. doi:10.1186/1472-6750-14-26 一方、一過性発現で300mg/L IgG(ただし、31℃14日間培養；J. Biotechnology, 153(1-2), 22–26. doi:10.1016/j.jbiotec.2011.03.001)という報告もありますので、結構CHO細胞のキャパシティーは高いようです。 COS細胞はどうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3638-6 - 2014/12/08 (月) 15:59:55 - おお >[Re:4] uuさんは書きました : > >[Re:3] yyyさんは書きました : > > > まあ、素人の漠然とした考えですが、Fcが付いてるからあまり大過剰に発現するとERのシャペロンとかがフル稼働になるか、misfoldingの産物が貯まってしまう危険性もあると思うので、そこそこの発現に抑えるというのは合理的な気もします。 > > なぜ？ > 抗体医薬とか相当高発現させてますよ。 確かに非常によく発現するものもあると思いますし、そう言うのを経験したことはあります。 ただgeneralにERからの輸送系、修飾系の飽和により分泌されにくくなったりという話はきいたことがあります。核の蛋白を発現していて、データーをみせたら、膜蛋白を発現させている人にその様な理由でうらやましがられたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.3638-5 - 2014/12/08 (月) 13:00:34 - yyy まあ、あくまでも素人考えなので、杞憂ならそれで良いんですがね。 まず、自分が持っていたイメージとして、immunoglobulin foldを持つ抗体分子は過剰発現させるとERに蓄積してUPRを誘発したり、かえって分泌が低下する（これはERシャペロンを共発現させることで改善するようですが）というものがあってのことです。ちなみに、自分がかなり以前に読んだ論文は思い出せなかったので、ざっと検索したら酵母にsingle-chain antibodyを過剰発現させた論文が見つかりました。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15990348/ 自分が以前読んだのが酵母だったか、mammalの培養細胞だったかは思い出せません。 発現が落ちないとしても、理論的にはシャペロンの相対的不足によるmisfolded proteinの増加などの心配もあると思います。 Fc-tagもimmunogobulin foldを持っていると思うので、大過剰に発現させたら同じような懸念があるかな？と思ったまでです。多分、発現させる細胞のQuality control/ERシャペロンが十分に対応出来るレベルなら問題ないのでしょう。 形質細胞などだったら「専門家」だから問題ないのでしょうが、COS7ではどうなのかな？と言うこともあります。 まあ、単なる素人の杞憂の可能性が高いと思いますけどね

(無題) 削除/引用 No.3638-4 - 2014/12/08 (月) 10:52:28 - uu >[Re:3] yyyさんは書きました : > まあ、素人の漠然とした考えですが、Fcが付いてるからあまり大過剰に発現するとERのシャペロンとかがフル稼働になるか、misfoldingの産物が貯まってしまう危険性もあると思うので、そこそこの発現に抑えるというのは合理的な気もします。 なぜ？ 抗体医薬とか相当高発現させてますよ。

(無題) 削除/引用 No.3638-3 - 2014/12/07 (日) 23:28:37 - yyy そもそも、EF1αプロモーターってCMVとかに比べて弱い、その代わり安定発現でのsuppressionの影響とかは受けにくい、と一般的には言われてるプロモーターですよね。細胞によっては違うのかも知れませんが。 もしかして、そのベクターは一過性発現で大過剰発現をするような実験向けに用いることは想定してないのではないでしょうか？ まあ、素人の漠然とした考えですが、Fcが付いてるからあまり大過剰に発現するとERのシャペロンとかがフル稼働になるか、misfoldingの産物が貯まってしまう危険性もあると思うので、そこそこの発現に抑えるというのは合理的な気もします。 Fc-fusionと言うことは培地に分泌されるのだろうし、比較的長いスパンで培地を回収していく、というのではダメなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3638-2 - 2014/12/07 (日) 21:11:51 - みけ The EF-1α promoter exhibits a strong activity and yields long lasting expression of a transgene in vivo.と書かれてありますね。ただ実際には細胞分裂に従い発現量は低下していくのでtransfectionから数日以内での回収を何度も繰り返す他ないのでは？ あるいはSV40oriを持つベクターに乗せ買えるのも手です。

Fc融合タンパク質用プラスミドとホスト細胞の相性について 削除/引用 No.3638-1 - 2014/12/06 (土) 07:52:01 - COS-7 質問させてください。今、あるタンパク質のFc融合タンパク質を作ろうと計画しています。 ホストの細胞はserum deprivation-adapted COS-7を用います。 プラスミドのバックボーンとして、二種類の選択肢があります。 一つは、pcDNA3.1+ベースのもので、C末にFcが融合するようになります。 もう一つは、pFUSE-hIgG2-Fc1というコマーシャルのもので、C末にFcが融合するようになります。 pFUSE-hIgG2-Fc1はコマーシャルなもなので、これに目的の遺伝子をクローニングしさえすれば分泌してくれるんでしょうが、このpFUSE-hIgG2-Fc1にはSV40oriが添付文書を見る限り、搭載されていないようです。 robustなタンパク質発現をCOS-7で期待したいような場合には、pFUSE-hIgG2-Fc1よりもpcDNA3.1+ベースの方がいいのでしょうか？ご意見いただけますと幸いに存じます。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---