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(無題) 削除/引用 No.3634-18 - 2014/12/10 (水) 12:11:16 - おお あ、もちろん長期exposureができるので従来のECLより強いシグナルを得ることもできるでしょうし、ECLplusに何とか近いところまで持っていけるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3634-17 - 2014/12/10 (水) 11:48:30 - おお >[Re:16] WBさんは書きました : > SuperSignal West Picoって ECL plusと同等の感度じゃありませんでした？ > 普通のECLよりかなり感度は良いと思ってました。 > ECL prime はplusより少し感度が上がって、ECL selectはもっと感度が高い。 > 試薬で感度上げるのも手っ取り早いですね。バックが出やすくなりますが。 ECLとECLplusの間くらいで発光のケミカルはECLと同じじゃないかな。うちではECLplusレベルの試薬をあっちこっちとっかえひっかえしてますが、サンプルをもらったときSuperSignal West Picoではそのレベルに達してなかったのでパスしました。 もちろん抗体量とかうまく調整してベストな条件を見つけると話が違ってくるかもしれませんけど。 http://www.piercenet.com/guide/guide-chemiluminescent-western-blot-substrates

(無題) 削除/引用 No.3634-16 - 2014/12/10 (水) 09:53:46 - WB SuperSignal West Picoって ECL plusと同等の感度じゃありませんでした？ 普通のECLよりかなり感度は良いと思ってました。 ECL prime はplusより少し感度が上がって、ECL selectはもっと感度が高い。 試薬で感度上げるのも手っ取り早いですね。バックが出やすくなりますが。

(無題) 削除/引用 No.3634-15 - 2014/12/10 (水) 03:06:43 - おお SuperSignal West Picoはそんなに感度が高い試薬でもないので、detectonに難があるなら一つ上のsensitivity がだせるやつにするといいかもです。ECL plusかそれ以降のものなど。

幻 削除/引用 No.3634-14 - 2014/12/09 (火) 10:15:23 - WB SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate使ってO/Nってかなりシグナル弱いですね。1st,2nd抗体の特異性をしっかり調べないとまずい。 サンプルロードする量や2ndをビオチン-アビジンでさらに増感するとかしたほうが良さそう。

(無題) 削除/引用 No.3634-13 - 2014/12/09 (火) 01:43:47 - おお > この業界で一般的に言えることですが、カタログの売り文句をあまり額面通りに受けない方が良いかと。 ideal situationという事での記述で確かに、そこまではいかなそうだなと感覚的にはおもいますね。発光し続けるとしても、強度はも徐々に落ちていっていると思いますし。 おそらくHRPと試薬を混ぜてプレーとリーダーとかで図ったりしてデーターとってるんじゃないかと思ったりもします。

(無題) 削除/引用 No.3634-12 - 2014/12/06 (土) 03:24:57 - ECL >[Re:11] yyyさんは書きました : > "usable"というのと"when conditions are optimized"と言う言葉がミソですかね。 > > この業界で一般的に言えることですが、カタログの売り文句をあまり額面通りに受けない方が良いかと。 yyyさんありがとうございます。 そうですよね。 私は諸事情により一時間でも早く結果が出るのなら時間を切り詰めたいです。 今はover nightで成功して「しまった」ので、それでずっと行っていますが、over night (12 hrs以上)を6-8時間に短縮できるのなら本当に嬉しいです。 'when conditions are optimized'で6-8時間なので、最高の条件でもってしても6-8時間で限界と読み取れますよね？ということは私のような素人がやるなら6-8時間やって出ないものはover nightでも出ないということになります。これは私にしたら大きな発見でした。笑 みなさまありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3634-11 - 2014/12/06 (土) 03:20:23 - yyy "usable"というのと"when conditions are optimized"と言う言葉がミソですかね。 この業界で一般的に言えることですが、カタログの売り文句をあまり額面通りに受けない方が良いかと。

(無題) 削除/引用 No.3634-10 - 2014/12/06 (土) 02:37:01 - ECL みなさまありがとうございます。 PierceのECLのページを見ると、 Good signal duration : incubated blots provide 6 to 8 hours of usable light output when conditions are optimized と書かれてありますが、6-8時間は持続するということですよね。 当然だと思いますが、最初の一時間と7時間目から一時間やるのとでは、強さは当然落ちますよね。 Over night (12 hrs以上) でやらなくても、6-8 hrs露出すれば、over nightのものと一緒ということですね。

(無題) 削除/引用 No.3634-9 - 2014/12/06 (土) 00:16:15 - おお >[Re:8] yyyさんは書きました : > HRPのself-inactivationですね。 > 不活化されたHRPが着いた二次抗体はそのままではepitopeを占有して邪魔になるので、新たに二次抗体から始めるならストリッピングが必要かと。 厳密にはそうなんですが、結合が強いといえ、後から加える方も親和性は同じぐらい強いですからexchangeはおきているようです。

(無題) 削除/引用 No.3634-8 - 2014/12/05 (金) 23:55:01 - yyy HRPのself-inactivationですね。 不活化されたHRPが着いた二次抗体はそのままではepitopeを占有して邪魔になるので、新たに二次抗体から始めるならストリッピングが必要かと。 exposureの話ですが、以前は最近名前が変わった某社のECLはGEのと遜色がないくらいシグナルが長持ちしてた印象があるのですが、最近のは20分も経てば明らかに弱くなってしまうと感じてます。長時間露光しても結果が変わらないか、最初のもの以上にはならないので最近は30分以上露光することはなくなって、感度が必要だと思ったらなるべく最初に20分位やってしまうようにしています。 リン光が長時間持続する製品も同社から別に売ってるみたいですが、今のところは必要が無いので試してはいません。 そういえば、某社のUltracompetent cellも会社名が変わってから明らかに品質が落ちた（細胞懸濁液が明らかに薄い）ので使わなくなりました。以前は比較的安くて高性能で愛用してたんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.3634-7 - 2014/12/05 (金) 16:20:36 - おお HRP自身は減りませんが、酵素活性の安定性が問題になるんじゃなかったかな。2次抗体からやり直したらいいかと。 あと私もO/Nでやることはあります。ただ最初の30ー 60minぐらいと、その後からO/Nではそんなにシグナルが変わらないような印象はあります。よわくて数分で見えないものはO/Nで出たりすることはまあまああります。

(無題) 削除/引用 No.3634-6 - 2014/12/05 (金) 16:09:41 - ECL >[Re:5] APさんは書きました : > peroxidaseが反応するとラジカルを生じるため酵素寿命は短いのです。 > > プロトタイプのECLだと、活性を保つのはせいぜい数分程度だったはずです。 > 今でこそ、酵素の寿命が長くlong exposureが可能であることをうたった製品がありますが（どうやら酵素そのものを改変したのではなく、企業秘密のスカベンジャーを添加しているとようだ、ということをさるメーカーの技術さんに聞きましたが）peroxidaseでo/nなんていうのは、あまり実用的でないと思います。 > > ところで、どのタイプの試薬を使っているのでしょう（selectやらprimeやらplusやらadvanceやら、duraとかpicoとか） AP様ありがとうございます。 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrateを使用しています。 http://www.piercenet.com/product/supersignal-west-pico-chemiluminescent-substrate over nightですと大体12 hrs exposeしています。 夜の9時や10時にfilmにexposeすることが多いので、そのままexposeしたまま帰る場合が多いです（今回の目的タンパク質に関しては）。 ECLによる化学発光を大まかにざっくり捉えるためには1時間もあれば十分でしょうか？ 一時間と24時間では結果は変わらないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3634-5 - 2014/12/05 (金) 16:05:39 - AP peroxidaseが反応するとラジカルを生じるため酵素寿命は短いのです。 プロトタイプのECLだと、活性を保つのはせいぜい数分程度だったはずです。 今でこそ、酵素の寿命が長くlong exposureが可能であることをうたった製品がありますが（どうやら酵素そのものを改変したのではなく、企業秘密のスカベンジャーを添加しているとようだ、ということをさるメーカーの技術さんに聞きましたが）peroxidaseでo/nなんていうのは、あまり実用的でないと思います。 ところで、どのタイプの試薬を使っているのでしょう（selectやらprimeやらplusやらadvanceやら、duraとかpicoとか）

(無題) 削除/引用 No.3634-3 - 2014/12/05 (金) 16:04:10 - ECL >[Re:2] abさんは書きました : > GEのECLの場合、反応によって酵素が失活するので異なる動物種の抗体を用いる場合はstrippingの必要はない、と記載がありますね。 > 各社検出試薬を出しており失活するかどうかは試薬によって異なると思いますが、二次抗体を再度載せるか、あるいは二次抗体に対する三次抗体を反応させる方法もあります。 ab様ありがとうございます。GEのものは使用したことがありませんが、酵素は失活してしまうんですね。知りませんでした。私のlabではpierceのECLを使用していますので、二次抗体を素直に乗せるのがてっとり早いですね。

(無題) 削除/引用 No.3634-2 - 2014/12/05 (金) 15:59:15 - ab GEのECLの場合、反応によって酵素が失活するので異なる動物種の抗体を用いる場合はstrippingの必要はない、と記載がありますね。 各社検出試薬を出しており失活するかどうかは試薬によって異なると思いますが、二次抗体を再度載せるか、あるいは二次抗体に対する三次抗体を反応させる方法もあります。

一度exposeし終えたメンブレンのre-exposeについて 削除/引用 No.3634-1 - 2014/12/05 (金) 15:42:53 - ECL お世話になります。 western blottingでとあるタンパクの検出を試みています。 が、細胞あたりの発現量が報告通り低く、ECLでovers nightでフィルムにexposeしないとbandが見えません。 いつも一次抗体は1 hr室温でのincubationなのですが、たまたま初めてover night, 4˚Cでincubationすると、フィルムにかなり強くbandが検出されました。それはそれで嬉しかったのですが、もう少し露出を下げても（例えば15 minとか。普段なら絶対に検出できなかったんですが。）検出できるのでは？と思うようになりました。 そこで質問なのですが、exposeし終えたmembraneに、再度新たにECLを加えて、その後filmにexposeすることでbandの検出は再び可能になるでしょうか？ HRPは酵素ですし、ECLとの反応で酵素そのものは減ることはありませんので、基質であるECLを新たに加えればそのmembraneを再び使えなくもないのでは？と思いました。そこで実際行ってみたんですが、全くbandが検出されませんでした。 すでにECLとincubationさせたmembraneはそれ一回限り発光するのみでしょうか？

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