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(無題) 削除/引用 No.3631-7 - 2014/12/14 (日) 18:07:12 - モモ Ureaはおすすめです。それでも溶けにくいですが。 細胞が濃すぎると溶けにくいので、必要以上に濃くしないほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3631-6 - 2014/12/07 (日) 23:06:16 - yyy >[Re:4] 424532さんは書きました : > yyy様はどれくらいの時間かけて乾燥していましたか? 煮沸できないというのは厄介ですね。 Sample bufferにUreaとか入れてないとしたら、試してみるのも手かも知れません。 ちなみに、自分は有機溶媒で沈殿後はペレットの表面/周囲の溶媒が完全に蒸発しててもペレット自体はまだ若干湿ってる、というような状態でsample bufferを加えるようにしています。

(無題) 削除/引用 No.3631-5 - 2014/12/06 (土) 15:53:55 - おお >[Re:4] 424532さんは書きました : > おお様 > 15000 rpmは強すぎたかもしれないですね。 > もう少し、遠心回転数を少なくして、sampleを回収できる条件を模索してみます。 弱い遠心で回収して、その上澄みはさらに強い遠心をして、2段階で回収するとあまり何も考えなくていいかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.3631-4 - 2014/12/06 (土) 15:07:46 - 424532 御二方早急のご返信ありがとうございます。 yyy様 アセトンでwashした後は、アセトンが残るとSDS化に支障がでると思ったのでデシケーターでタンパク沈殿をカピカピになるまで乾燥していました。 yyy様はどれくらいの時間かけて乾燥していましたか? おお様 15000 rpmは強すぎたかもしれないですね。 もう少し、遠心回転数を少なくして、sampleを回収できる条件を模索してみます。dishにsample bufferを添加して細胞を溶解していた時期もありましたが、sample回収後、SDS化で過熱する際に煮沸すると分解してしまうようなsampleなので、トロトロの液になった際の処理が非常に大変(ソニケーション等)ということでTCA処理を行っています。

(無題) 削除/引用 No.3631-3 - 2014/12/05 (金) 02:10:42 - おお まあ溶けにくいです。くわえてなんで溶かしても解けないものはでてきます。一定の効率でいつも溶けているなら再現性が保証されるのでその場合はそれでよしです。 加えて他の回答者の指摘にもありますが、乾燥してしまうと溶けにくくなり、再現性が悪くなる可能性はあるとおもいます。 TCAは強い酸性なのでしっかり除けているかというのもネックになるとおもいます。あと溶かすとき塩がいくらかあった方が溶けやすいものもあります。尿素などをつかうひともいます。ソにケーションするひともいるでしょう。 弱い遠心でかいしゅうして、そのフラクションは洗うときも弱い遠心をつかうひともいます。 最初の弱い遠心での上澄みは強い遠心で別個に洗って最後に一つのチューブにあわせるとロスがなくなるかもしれません。 お示しの方法が標準的かどうかはおいといて、TCAを使うメリットもあると思いますが、直接dishの細胞にサンプルバッファーをかけるのはあなたの実験についてはだめですか?

(無題) 削除/引用 No.3631-2 - 2014/12/05 (金) 01:07:11 - yyy 有機溶媒で沈殿した後のタンパクのペレットは乾燥し過ぎると溶けにくくなります。 その辺の加減は大丈夫でしょうか？

SDS-PAGE(WB)のsample調製 削除/引用 No.3631-1 - 2014/12/05 (金) 00:56:49 - 424532 いつも勉強させていただいてます。 現在、付着系細胞を10% TCAで4℃、1 hで固定後、細胞を回収し、15000 rpm, 4℃、10minで遠心し、上清除去後、アセトンでwashを2度行い、上清除去し、減圧乾燥後、SDS bufferを添加し、可溶化させていますが、タンパクの沈殿が溶けません。 ごく標準的なprotocolだと思いますが、なぜ溶けないのか理由がわかりません。 ご教授いただけたら幸いです。

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