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(無題) 削除/引用 No.363-8 - 2012/04/05 (木) 14:10:39 - 福地 ＞APさま どうもありがとうございます。 Primerは全試薬新調時、新しいStockを溶かすところから変えました。 また、配列も確認しましたが間違っておりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.363-7 - 2012/04/04 (水) 18:55:15 - AP >A型、B型のTypingはPrimer設計に基づいています。 >２基塩基が異なると増幅されないという論文に基づき、 >配列の異なる部位を選んで増幅させています。 >実際、これまで数年間、A型、B型を見分けてきました。 とのことですので、 >ある日突然、ほぼ全てのサンプルにおいてA型陽性になってしまいました。 という現象の原因として、劣化によりA型プライマーの3'末端が削れてしまって、タイプに関係なく増幅が起こるようになったという可能性があると思います。プライマーのworking solutionのほかにストックがあるなら、そこから調製しなおすとか、新しく合成しなおしてみては。 >ネガコンも弱いながら陽性でした。したがって正しい結果ではないと判断しました。 >さらに、スタンダード直線がきれいに出ず、段階的な増幅が確認されません。 >電気泳動したところ、通常のPCRよりもTemplate数が少ないのでうっすらとしかバンドは確認できませんでした。 という状況は、系がうまく動いていないということを匂わせます（上記のようにプライマーの品質が良くないのが原因かも）。 いくら標的が微量でも、系がうまく走っていればきっちり増幅するはずですし、そうでなくてはリアルタイムPCRによる解析は信頼性に乏しいんじゃないでしょうか（何かデータが出たとしても単にノイズ、アーティファクトを拾っている？）。

電気泳動結果です 削除/引用 No.363-6 - 2012/04/04 (水) 18:17:34 - 福地 電気泳動したところ、通常のPCRよりもTemplate数が少ないのでうっすらとしか バンドは確認できませんでした。 しかしながら、ネガコン、Standard、サンプルともに目的の大きさ付近にバンドが見られ、 Standardに関してはTemplate濃度依存的にバンドの濃さが変化しているようです。 しかし、バンドが本当に薄いので、目的の物を見ているかは言い切れません。 ＞APさま ご指摘ありがとうございます。 おっしゃるとおり、Taqman Probeを用いています。 A型、B型のTypingはPrimer設計に基づいています。 ２基塩基が異なると増幅されないという論文に基づき、 配列の異なる部位を選んで増幅させています。 実際、これまで数年間、A型、B型を見分けてきました。 ほかの研究者も同じPrimerとProbeのセットを使用していると思われます。 今、抽出したRNAにDNAse処理を行ってから、逆転写し、 Real-Time　PCRにかけてみようとしています。

(無題) 削除/引用 No.363-5 - 2012/04/04 (水) 16:24:56 - AP タイピングに用いている多型はどの程度のもので、多型の判別原理はなにかということについて、説明を加えたほうがいいのでは？ 見たところ、Taqman probeによる方法みたいですが、それだと電気泳動してバンドがちゃんと出ているかをみてもあまりinformativeではないかも。

(無題) 削除/引用 No.363-4 - 2012/04/04 (水) 13:24:51 - 福地 ご指摘の通り、Real-time　PCRに用いたサンプルを使用し、 電気泳動を試みることにしました。 追って結果をUPしますので、どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.363-3 - 2012/04/04 (水) 13:22:54 - 福地 さっそくのお返事どうもありがとうございます。 お世話になります。 ＞どのようなネガコンをおいていて、その結果はどうなのでしょうか？ ネガコンの情報を入れ忘れ、申し訳ありませんでした。 Protcolとしては、 １．RNAを抽出 ２．逆転写 ３．Real-time PCRでプローブのシグナルを検出 で行っています。 ネガコンは３のPCR時、PrimerとProbeのMixにTEを入れたものを使用しています。今回、ネガコンも弱いながら陽性でした。したがって正しい結果ではないと判断しました。さらに、スタンダード直線がきれいに出ず、段階的な増幅が確認されません。 電気泳動は普段は行っていません。 今回の件が起こる１週間前、条件設定のために、試験的に電気泳動装置を動かしました。 試薬調整、サンプル調整、スタンダード調整は全て３つのドラフトで別々に行っており、ピペットもそれぞれ別のものを使用しています。 また、チップはフィルター入りを用いています。

(無題) 削除/引用 No.363-2 - 2012/04/04 (水) 10:11:38 - ~ どのようなネガコンをおいていて、その結果はどうなのでしょうか？ また、サンプルが実は全て感染者のものだったということは無いのですか？ その2つが分からないと、正しい結果で”ない”ことが説明できないと思いますが。 また、この場合の”陽性”は、Real-Time PCR機械のシグナルで見ているのでしょうか？ それともPCR後に泳動して、A型の位置にバンドがあるところまでを見ているのでしょうか？ 前者であれば、まずは泳動してみてはいかがでしょうか。 非特異にラダーになっているのか、A型のシングルバンドが出ているのかでは、対応策が変わってくるかと思います。 後者であれば、使用しているチップはフィルター付きでしょうか？ ピペットマンが汚染している場合、PCR溶液の調整時にコンタミする怖れがあります。 フィルター付きチップを使うことで非特異が見られなくなるのであれば、ピペットマンが原因と考えられるでしょう。 （この場合はテンプレート無しのネガコンでも増えるはずなので、そこでもチェックできると思いますが）

Real-Time PCR　の非特異反応 削除/引用 No.363-1 - 2012/04/04 (水) 09:17:39 - 福地 Real-Time PCRにおける非特異反応の原因について教えてください。 ヒトの便から採取したウィルスのRNAを逆転写後、 Real-Time PCRにかけています。 このRNAにはA型、B型の２つの遺伝型があり、 A型は、サンプルのうち陽性が出る確率は常に数％でした。 ところが、ある日突然、ほぼ全てのサンプルにおいてA型陽性になってしまいました。試薬のコンタミを疑い、全ての試薬を作り直したのですがいまだに解決していません。 このような場合、どこに原因があると考えられますか？ 現状は以下のようです。 １．同時に行っているB型のほうは通常通りの陽性率です。 ２．手でRNA抽出した場合も、自動の機械を使用してRNA抽出した場合も、同様に全て陽性という結果が出ました。 ３．Real-Time PCRのスタンダード曲線がきれいに出ません。 ４．２つのReal-Time PCR機械で行いましたが、２つとも同様に全て陽性でした。 ５．１００％陽性が出る少しまえ、同じ部屋で電気泳動の機械を作動、A型陽性のPCR産物を泳動しました。 よろしくお願いします。

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